楊燦，沈根祥，胡雙慶,*，朱英，張洪昌，曹國民,#

1. 華東理工大學(xué)，上海 200237 2. 上海市環(huán)境科學(xué)研究院，上海 200233

氯霉素(chloramphenicol, CHL)是首種被大規(guī)模生產(chǎn)的抗生素[1]，具有廣譜殺菌效果，能有效抑制多種好氧和厭氧微生物，是一種非常有效的獸藥。同時，氯霉素曾被推薦用于預(yù)防沙門氏菌感染，被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)[2]。但氯霉素有嚴(yán)重毒副作用，水中殘留氯霉素會誘發(fā)致病菌的耐藥性，易引起粒狀白細(xì)胞缺乏癥、再生障礙性貧血等癥狀，對人類健康構(gòu)成巨大的威脅，表現(xiàn)出潛在的生態(tài)和健康風(fēng)險[3]。食用水產(chǎn)品中氯霉素的殘留是不可接受的，基于人類健康角度，氯霉素已被我國列入漁藥禁用清單[4]，但目前仍然可以在水生生物體內(nèi)和環(huán)境介質(zhì)中檢出[5-7]。

大型溞(Daphniamagna)是國際公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)試驗生物，自1978年被美國環(huán)境保護(hù)局(EPA)確認(rèn)作為毒理生物模型以來，以其對毒物敏感、取材容易、試驗方法簡便等多種優(yōu)點(diǎn)，受到科學(xué)界的重視和關(guān)注[8-9]。大型溞生活于自然水域，屬于浮游甲殼類動物，是水生浮游動物的代表，是連接水生食物鏈的重要中間體，與大部分環(huán)境介質(zhì)都有相互作用，因此與其他水生生物相比，更容易受到攝入污染物顆粒的影響，且對凈化水體有重要作用，是監(jiān)測評價水環(huán)境質(zhì)量的重要指標(biāo)[10]。

目前，以大型溞為受試生物的毒性研究主要局限于農(nóng)藥(如三氯殺螨醇[11]、草甘膦[12])、阻燃劑(如四溴雙酚A和三溴苯酚[13]、2,2’,4,4’-四溴二苯醚[14])等，關(guān)于抗生素對大型溞的毒性研究，主要集中在四環(huán)素類、磺胺類、氟喹諾酮類[15]，對于氯霉素的研究報道比較缺乏。因此，本研究以大型溞為受試生物，考察氯霉素對大型溞的48 h急性毒性和21 d慢性毒性效應(yīng)，為水環(huán)境中氯霉素的毒性效應(yīng)評估提供科學(xué)依據(jù)，并通過急性毒性和慢性毒性效應(yīng)結(jié)果的比較，確定氯霉素的急慢性毒性比，為氯霉素的環(huán)境風(fēng)險表征提供生態(tài)毒理數(shù)據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料和儀器

受試生物大型溞溞種來自上海海洋大學(xué)，經(jīng)本實驗室室內(nèi)保種培養(yǎng)，表觀健康，喂食小球藻(Chlorellasp.)。急慢性實驗受試大型溞為本實驗室培養(yǎng)的同一健康親溞孤雌生殖3代以上的幼溞，溞齡24 h以內(nèi)，均為健康、活潑、體型均勻的個體。實驗液均用Elendt M7培養(yǎng)基，實驗之前，母溞在Elendt M7培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)7～10 d，培養(yǎng)條件為19～21C，光暗比為 8 h:16 h，光照強(qiáng)度為1 000～1 500 lux。急性實驗期間不喂食，慢性毒性實驗開始，用小球藻濃縮液定期投放，投餌量(以碳計)為0.1～0.2 mg·溞-1·d-1。

受試物氯霉素為HPLC級的標(biāo)準(zhǔn)品，購自中國國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，氯霉素基本理化性質(zhì)見表1。HPLC分析使用Milli-Q超純水，使用甲醇為優(yōu)級純，購自TEDIA公司。Elendt M7培養(yǎng)基主要藥劑成分包括H3BO3、MnCl2·4H2O、RbCl、Na2MoO4·2H2O、Na2SiO3·9H2O、維生素B1、維生素H、維生素B12等，其中H3BO3、MnCl2·4H2O、RbCl、維生素B1、維生素H均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，H3BO3、MnCl2·4H2O為分析純，RbCl為光譜純；Na2MoO4·2H2O、Na2SiO3·9H2O購自中國醫(yī)藥(集團(tuán))上海化學(xué)試劑公司，均為分析純；維生素B12購自北京索萊寶科技有限公司。

主要儀器：高效液相色譜儀(Waters e2695，沃特世科技(上海)有限公司)，光照培養(yǎng)箱(MLR-352-PC, Panasonic)，pH計(S220，梅特勒-托利多)，溶解氧測定儀(SevenExcel lence, YSI Instruments)。

1.2 實驗方法

1.2.1 氯霉素分析方法建立及方法學(xué)驗證

為確認(rèn)實驗期間氯霉素的穩(wěn)定性及換水頻率，采用HPLC分析實驗溶液中氯霉素的濃度。高效液相色譜檢測器為紫外檢測儀，參考文獻(xiàn)[16]進(jìn)行流動相優(yōu)化，確定液相條件為：XBridgeTMC18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為水-甲醇(V:V=30:70)，柱溫25C，檢測波長274 nm，流速1 mL·min-1，進(jìn)樣10 μL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限：準(zhǔn)確稱取氯霉素標(biāo)品，用甲醇溶解制成1 000 mg·L-1的溶液。逐步稀釋后得到濃度組A：0.41、1.23、3.70、11.11、33.33 mg·L-1和濃度組B：11.11、33.33、100.00、300.00、600.00 mg·L-1，按上述液相條件進(jìn)行測定。采用3倍信噪比(S/N)計算檢出限(LOD)，采用10倍信噪比計算定量限(LOQ)。

精密度分析：準(zhǔn)確稱取氯霉素標(biāo)品，配制濃度為1 000.00 mg·L-1的儲備液，逐級稀釋為0.625、20.00、100.00 mg·L-1的樣品，各樣品均連續(xù)進(jìn)樣7次。

回收率分析：準(zhǔn)確稱取氯霉素標(biāo)品，配制濃度為1 000.00 mg·L-1的儲備液，逐級稀釋為0.625、20.00、125.00 mg·L-1的樣品，各濃度均3份，通過HPLC測定濃度，以實測濃度與理論濃度比計算回收率。

穩(wěn)定性分析：準(zhǔn)確稱取氯霉素標(biāo)品，配制濃度為1 000.00 mg·L-1的儲備液，逐級稀釋為0.625、20.00、500.00 mg·L-1的樣品，分別于0 h、24 h、48 h取樣測定。

急性毒性實驗在0 h、24 h、48 h取水樣，慢性毒性實驗在0 d、8 d、16 d、21 d換水前后取水樣，通過HPLC測定溶液中氯霉素實際濃度。

1.2.2 急性毒性實驗

實驗方法參照OECD202[17]和GB/T 16125—2012[18]的方法。通過預(yù)實驗，設(shè)置間隔較大的5個測試濃度，得出氯霉素對大型溞急性活動完全不抑制的最高濃度和100%活動抑制的最低濃度，從而確定正式實驗的濃度范圍。正式實驗設(shè)置5個濃度組，分別為31.25、62.50、125.00、250.00、500.00 mg·L-1，同時設(shè)空白對照組。實驗用100 mL燒杯，內(nèi)盛50 mL實驗溶液，每個濃度設(shè)4個平行，每個燒杯中加入5只幼溞。放入培養(yǎng)箱中，溫度控制在(20±1)C，光暗比8 h:16 h，暴露時間48 h，實驗期間不喂食，不更換實驗溶液。實驗開始后，于24 h和48 h觀察并記錄大型溞活動抑制情況，并記錄其他任何異常癥狀或表現(xiàn)。在0 h、24 h、48 h時測定并記錄實驗溶液溫度、pH及溶解氧，同時取水樣通過HPLC測定水樣中氯霉素的實際濃度。

1.2.3 慢性毒性實驗

實驗方法參照OECD 211[19]和GB/T 21828—2008[20]的方法。根據(jù)氯霉素對大型溞急性毒性的實驗結(jié)果，選擇在20 mg·L-1內(nèi)以2為等比設(shè)置6個濃度梯度，分別為0.625、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 mg·L-1，同時設(shè)空白對照組。每個濃度設(shè)10個平行，每個燒杯中加入1只親溞。實驗持續(xù)21 d，實驗溫度(20±1)C，光暗比8 h:16 h，光照強(qiáng)度為1 000～1 500 lux，每48 h更換一次實驗溶液。每天喂食小球藻濃縮液，喂食量(以碳計)為0.1～0.2 mg·溞-1·d-1。實驗開始后，每天觀察并記錄大型溞存活和繁殖情況，從培養(yǎng)皿中移出幼溞并計數(shù)。在0 d、8 d、16 d、21 d更換實驗溶液前后測定并記錄實驗溶液溫度、pH、溶解氧，同時取水樣通過HPLC測定水樣中氯霉素的實際濃度。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用概率單位法(Probit，SPSS 22.0)分析急性毒性和慢性毒性實驗數(shù)據(jù)，得出EC50及95%置信限。急性毒性采用SPSS 22.0軟件中單因素方差分析(One-way ANOVA)方法，確定不同濃度氯霉素是否對大型溞死亡產(chǎn)生影響，慢性毒性采用單因素方差分析中的鄧肯檢驗(Duncan)進(jìn)行分析，確定不同濃度氯霉素對大型溞繁殖的影響及差異性。

表1 氯霉素的基本理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of chloramphenicol (CHL)

注：pKa表示酸度系數(shù)；logP表示油水分配系數(shù)。

Note： pKa stands for acidity coefficient; logP stands for oil-water partition coefficient.

2 結(jié)果(Results)

2.1 實驗溶液氯霉素濃度分析及穩(wěn)定性

以氯霉素峰面積為縱坐標(biāo)(y)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，進(jìn)行線性回歸分析，濃度組A和B的結(jié)果見圖1。由圖可知，氯霉素檢測濃度在0.41～600.00 mg·L-1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈極好的線性關(guān)系(R2>0.999)，檢出限為0.019 mg·L-1，定量限為0.064 mg·L-1。精密度實驗結(jié)果顯示，濃度為0.625、20.00、100.00 mg·L-1的氯霉素峰面積的RSD分別為0.38%、0.58%、2.28%(n=7)，說明儀器的精密度良好。回收率分析結(jié)果見表2，從低到高濃度分別為0.625、20.00、125.00 mg·L-1的氯霉素的平均回收率分別為100.59%、100.73%、99.29%，說明回收率良好。穩(wěn)定性分析結(jié)果顯示，濃度為0.625、20.00、500.00 mg·L-1的氯霉素在48 h后濃度實測為0.523、17.89、458.63 mg·L-1，表明48 h內(nèi)實際濃度均在設(shè)定濃度的80%范圍內(nèi)，因而本實驗以48 h作為換水頻率。

慢性和急性毒性實驗中氯霉素濃度分析結(jié)果見表3和表4。結(jié)果顯示，氯霉素在整個實驗期間，實測濃度都在設(shè)定濃度的80%～110%范圍內(nèi)。因此，可用實驗設(shè)定濃度來代替實際濃度計算氯霉素對大型溞的急性和慢性毒性效應(yīng)值。

圖1 氯霉素濃度分析標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 Standard curve for CHL concentration determination

加入量/(mg·L-1)Addition/(mg·L-1)測得量/(mg·L-1)Measured value/(mg·L-1)回收率/%Recovery rate/%0.6250.6320.6300.624100.59±0.6620.0020.1320.1020.21100.73±0.29125.00124.16123.10125.0699.29±0.78

表3 慢性毒性實驗氯霉素濃度分析結(jié)果Table 3 Analysis results of CHL concentration in chronic toxicity test

2.2 大型溞的急性毒性效應(yīng)

急性毒性實驗過程中溶液pH在7.35～8.03范圍內(nèi)，溫度控制在19.9～20.7 °C，溶解氧保持在9.00～9.38 mg·L-1之間?？瞻讓φ战M的大型溞狀況良好，無活動抑制發(fā)生。暴露24 h時，僅高濃度組出現(xiàn)活動抑制現(xiàn)象，抑制表現(xiàn)為體態(tài)發(fā)白并沉于溶液底部，250.00 mg·L-1濃度組抑制率為30%，500.00 mg·L-1濃度組抑制率為60%。隨著暴露時間延長到48 h，250.00 mg·L-1和500.00 mg·L-1濃度組大型溞均已全部抑制，125.00 mg·L-1濃度組也出現(xiàn)活動抑制，抑制率為40%。可見，隨著暴露時間的延長，大型溞的活動抑制率上升，呈明顯的時間-效應(yīng)關(guān)系，通過計算不同暴露時間大型溞急性毒性EC50值，可為后續(xù)慢性毒性實驗的濃度設(shè)置提供參考。方差分析表明，氯霉素暴露對大型溞的活動產(chǎn)生顯著抑制(F>>1)。

氯霉素對大型溞的急性活動抑制實驗結(jié)果見表5。氯霉素對大型溞的48 h-EC50為129.47 mg·L-1，95%置信區(qū)間為124.36～150.89 mg·L-1。根據(jù)我國原國家環(huán)境保護(hù)局《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則》[21]中大型溞的毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，氯霉素對溞類屬于低毒物質(zhì)。

2.3 大型溞的慢性毒性效應(yīng)

慢性毒性實驗過程中溶液pH在7.10～8.76范圍內(nèi)，溫度控制在19.2～20.3 °C，溶解氧保持在8.04～9.50 mg·L-1之間。實驗結(jié)束時，各組親溞死亡率均未超過20%，平均每只存活親溞所產(chǎn)成活幼溞數(shù)大于60只，證明了實驗的有效性。14 d、21 d時氯霉素對大型溞的半數(shù)抑制濃度分別為15.91和15.59 mg·L-1(表6)。圖2顯示了各濃度組頭胎溞的出生時間及總數(shù)，頭胎溞總數(shù)為首次出現(xiàn)小溞當(dāng)天10組平行產(chǎn)溞數(shù)總和。其中，空白組于實驗第8天開始有部分親溞產(chǎn)溞，總產(chǎn)溞數(shù)量為5只；0.625 mg·L-1濃度組第7天開始部分親溞產(chǎn)溞，總產(chǎn)溞數(shù)4只；1.25 mg·L-1濃度組整體產(chǎn)溞時間推遲，但各親溞均開始產(chǎn)溞，在實驗第11天總產(chǎn)溞60只；2.50、5.00、10.00、20.00 mg·L-1濃度組頭胎溞的出生時間在8～9 d之間，總數(shù)為2～9只。圖3為不同暴露濃度氯霉素對親溞產(chǎn)溞總數(shù)影響的統(tǒng)計分析結(jié)果，其總產(chǎn)溞數(shù)為21 d內(nèi)平均單個親溞產(chǎn)小溞總數(shù)。當(dāng)暴露時間為14 d時，0.625、1.25 mg·L-1濃度組與空白組相比無顯著性差異，當(dāng)氯霉素濃度提高到2.50 mg·L-1時，開始對大型溞繁殖產(chǎn)生顯著抑制作用。當(dāng)暴露時間為21 d時，氯霉素5.00 mg·L-1以上濃度組，對大型溞的繁殖產(chǎn)生顯著抑制，產(chǎn)溞數(shù)量由空白對照組的均值69只減少至均值57只以下。由此可見，氯霉素能抑制大型溞的繁殖，其對大型溞21 d繁殖實驗的LOEC為2.50 mg·L-1，NOEC為1.25 mg·L-1。

2.4 急慢性毒性比

圖2 氯霉素對親溞首次產(chǎn)溞時間及產(chǎn)溞數(shù)量的影響注：柱外數(shù)據(jù)代表頭胎溞出生時間。Fig. 2 Effects of CHL on the first brood time and size of Daphnia magnaNote: The number out of the column means the first brood time.

暴露時間TimeEC10/(mg·L-1)EC50/(mg·L-1)EC10 95%置信區(qū)間/(mg·L-1)EC10 95% confidential interval/(mg·L-1)EC50 95%置信區(qū)間/(mg·L-1)EC50 95% confidential interval/(mg·L-1)24 h209.97426.54NA324.29～649.9048 h102.94129.4725.13～113.10124.36～150.89

注：NA表示不適用。

Note： NA means not applicable.

在毒性實驗中，由于慢性毒性實驗花費(fèi)時間較長，對實驗條件要求高，人力物力消耗也較大，因此發(fā)展出利用固定因子來評估有害物質(zhì)在環(huán)境中慢性影響的方法，即急慢性毒性比值(ACR)。根據(jù)國內(nèi)外文獻(xiàn)報道，Rodriguez等[22]通過急性毒性48 h-EC50除以慢性毒性數(shù)據(jù)計算ACR，袁慈君[23]以急性毒性的EC10取代慢性毒性數(shù)據(jù)計算ACR。本研究ACR1以48 h-EC50/chV(chronic value)計算，chV為NOEC與LOEC的幾何平均值；同時與用急性毒性的EC10求出的ACR2(ACR2=48 h-EC50/48 h-EC10)進(jìn)行比較，結(jié)果見表7?？梢?，ACR1是ACR2的58倍，水生生物毒性的ACR推薦值在100左右[24]，因而說明急慢性毒性比選用ACR1更加合理。

3 討論(Discussion)

氯霉素對大型溞的急性毒性48 h-EC50為129.47 mg·L-1，其對溞類屬于低毒物質(zhì)。李霞[25]報道了氯霉素對隆線蚤(Daphniacarinata)的48 h-EC50為192.60 mg·L-1，與本研究結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，大型溞比隆線蚤對氯霉素更為敏感。另外，王慧珠等[26]等報道了四環(huán)素和金霉素對大型溞的48 h-EC50分別為617.2 mg·L-1和137.6 mg·L-1，Wollenberger等[27]報道了土霉素對大型溞的48 h-EC50為1 000 mg·L-1。與上述幾種抗生素相比，氯霉素對大型溞的急性毒性最強(qiáng)。

氯霉素對大型溞的慢性毒性21 d-EC50為15.59 mg·L-1，其長期暴露能抑制大型溞的繁殖。Martins等[28]等報道了氟苯尼考對大型溞的21 d-EC50為7.6 mg·L-1。Wollenberger等[27]等報道了土霉素和四環(huán)素對大型溞的21 d-EC50分別為44.8 mg·L-1和46.2 mg·L-1，且長期暴露降低大型溞的產(chǎn)溞數(shù)量。相比于四環(huán)素類抗生素，氯霉素類抗生素對大型溞的慢性毒性相對較高。

人們希望能通過急性毒性實驗結(jié)果推測長期暴露下的安全濃度。一般而言，當(dāng)缺乏慢性毒性實驗結(jié)果時，通過ACR值來推測慢性毒性的值。本研究利用慢性毒性數(shù)據(jù)得到的ACR1值為73.15，利用急性毒性數(shù)據(jù)EC10求出的ACR2值為1.26，顯然ACR1值更接近推薦值100，這說明在環(huán)境風(fēng)險評估中，若使用急性毒性數(shù)據(jù)EC10取代慢性毒性數(shù)據(jù)NOEC，很可能會對ACR取值造成較大影響。同時，劉少穎等[29]求得阿維菌素、聯(lián)苯菊酯、氯菊酯和氟氯氰菊酯4種殺蟲劑對大型溞的ACR介于6.17～134.4。Hickey[30]求得Cr6+、五氯苯酚、硼、氟化物及硫酸鹽廢水池出水5種有害物對大型溞的ACR介于1.3～13.5?？梢?，不同物質(zhì)對大型溞的ACR值差異較大，在缺乏慢性毒性數(shù)據(jù)時，采用ACR值來預(yù)測安全濃度需謹(jǐn)慎。

圖3 不同時間段氯霉素對親溞產(chǎn)溞數(shù)量的影響Fig. 3 Effects of CHL on the number of total offspring per female of Daphnia magna during different periods

暴露時間TimeEC50/(mg·L-1)95%置信限/(mg·L-1)95% confidential interval/(mg·L-1)14 d15.91NA21 d15.5911.74～23.81

表7 氯霉素對大型溞的急慢性毒性比Table 7 Acute and chronic ratio of CHL to Daphnia magna

注：EC10表示10%抑制濃度，EC50表示半數(shù)抑制濃度，NOEC表示無可觀察效應(yīng)濃度，LOEC表示最低可觀測效應(yīng)濃度，ChV表示NOEC與LOEC的幾何平均值，ACR1和ACR2為急慢性毒性比值。

Note： EC10stands for concentration for 10% of maximal effect; EC50stands for concentration for 50% of maximal effect; NOEC stands for no observed effect concentration; LOEC stands for the lowest observed effect concentration; ChV stands for the geometric mean of NOEC and LOEC; ACR1and ACR2stand for the acute and chronic ratio.

綜上所述，氯霉素對大型溞屬于急性毒性低毒物質(zhì)，但長期暴露會抑制大型溞的繁殖，研究結(jié)果可為氯霉素的環(huán)境風(fēng)險表征提供生態(tài)毒理數(shù)據(jù)。