朱飛龍，郝偉玉，胡曉，焦萌，常靜，李濟彤，李建中，李偉，王會利,*

1. 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，北京 100085 2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

農(nóng)藥作為使用量最大、使用范圍最廣的化學(xué)品，其使用過程中，直接到達有害生物體的量不到施用量的0.3%，其余99.7%直接進入環(huán)境[1]，被認為是陸地環(huán)境的主要污染物[2]。三唑類殺菌劑是農(nóng)藥發(fā)展史上最引人注目的一類農(nóng)藥，它能通過抑制羊毛甾醇14α-脫甲基酶(CYP51)來限制真菌麥角甾醇的生物合成[3]，從而達到殺菌的效果。因此，三唑類殺菌劑被大量使用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)之中，用來保護農(nóng)作物或蔬菜免受真菌感染[4]。三唑類殺菌劑大多都有手性，它們有1個或2個手性中心，擁有多個對映體[5]。不同對映體對生物體的毒性、致癌性、致突變性以及內(nèi)分泌干擾都有一定的對映選擇性[6]。腈菌唑是一種常見的三唑類殺菌劑，它有一個手性中心，2個對映體，被歸類為中等有毒物。2014年糧農(nóng)組織/世衛(wèi)組織農(nóng)藥殘留聯(lián)合會議(JMPR)發(fā)現(xiàn)，腈菌唑影響老鼠/兔子的繁殖和發(fā)育能力，并導(dǎo)致一些幼仔出現(xiàn)死亡、肝細胞出現(xiàn)空泡化、肝細胞肥大和睪丸萎縮[7]。先前的研究也表明了腈菌唑?qū)τ丑w間的不同生理和生物學(xué)特性[7-9]。因此，有必要從對映體的層面對腈菌唑的生態(tài)風險有一個準確而完整的評價。

肝臟能夠利用各種代謝解毒酶，是解毒過程和氧化應(yīng)激發(fā)生的重要場所[10]，同時也是大多數(shù)外源物質(zhì)代謝的主要部位。細胞色素P450(Cytochrome P450, CYP450)是一相代謝酶，它們在外源物質(zhì)的代謝和解毒方面起重要作用[11-12]。當外源物質(zhì)的毒性超過肝臟代謝承受能力時，就會造成肝臟損傷，并對CYP450酶基因的表達產(chǎn)生一定影響。之前的研究表明，伊曲康唑暴露對大鼠的肝臟造成了一定程度的組織病理學(xué)損傷[10]。在氟康唑和丙環(huán)唑暴露后，大鼠肝組織出現(xiàn)了細胞肥大現(xiàn)象且CYP450酶基因(如CYP1A2、CYP2G1、CYP3A3等)的表達也發(fā)生了改變[13]。因此，肝組織病理學(xué)變化和CYP450酶基因的表達變化可以作為評價外源物質(zhì)毒性的指標。

爬行動物在生態(tài)系統(tǒng)中占據(jù)著重要地位，但對爬行類動物生態(tài)毒理學(xué)方面的研究相對較少[14]，更缺乏農(nóng)藥等環(huán)境污染物對爬行動物毒性作用機制的認識[15]。與其他爬行動物(鱷魚或海龜)不同，蜥蜴體型小，對環(huán)境變化敏感，易于在實驗室飼養(yǎng)[16]。因而，近年來，許多研究都使用蜥蜴來研究爬行動物毒理學(xué)[16-17]。麗斑麻蜥(Eremiasargus)是我國的本土蜥蜴，廣泛分布于長江以北。目前，我們實驗室已經(jīng)成功實現(xiàn)了麗斑麻蜥的實驗室培養(yǎng)并對其生物學(xué)背景進行了初步研究。因此，在本研究中，麗斑麻蜥被選為實驗動物來代表爬行動物進行生態(tài)毒理學(xué)研究。

為了探究腈菌唑?qū)τ丑w對麗斑麻蜥肝臟的毒性影響，受試蜥蜴分別暴露于(+)-腈菌唑(MT1)和(-)-腈菌唑(MT2)，對蜥蜴肝組織切片和代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達變化進行觀察記錄。本研究探討了腈菌唑2種單體對蜥蜴肝臟的毒性差異，為三唑類手性農(nóng)藥對蜥蜴或其他爬行動物的毒理學(xué)研究提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 化學(xué)品和試劑

分析純的腈菌唑消旋體(純度>99.0%)從農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)化學(xué)品控制研究所(北京)獲得。其他相關(guān)液體試劑均購自化學(xué)試劑有限公司(北京)。單體分離前，外消旋的腈菌唑儲存在乙腈(分析純)中，4 ℃避光保存。

1.2 腈菌唑單體分離

在Agilent 1260高效液相色譜(HPLC)上使用手性柱(CHIRALCEL OD-3R)分離(+)-腈菌唑(MT1)和(-)-腈菌唑(MT2)。紫外檢測波長為220 nm，流動相為乙腈和純水(40:60，V/V)的混合物，流速為1.0 mL·min-1，進樣量為20 μL。分離得到的2種對映異構(gòu)體的純度均>97%。分離后，將MT1和MT2溶于乙醇中，然后用玉米油(乙醇∶玉米油1:9，V/V)稀釋。混合液在4 ℃中遮光貯存，暴露實驗前先平衡至室溫，然后混合均勻使用。

1.3 蜥蜴飼養(yǎng)

成年(約2～3年)的雄性蜥蜴來自我們實驗室的蜥蜴繁殖基地(北京昌平區(qū))。在暴露實驗中使用體重(4.0～4.5 g)和長度(50～60 mm)相似的蜥蜴。蜥蜴放置在一個5 m×1.2 m×0.4 m的室內(nèi)玻璃箱中，底部覆蓋有10 cm厚的細砂土。在玻璃箱中，放置一些水碟、遮蔽物和樹枝，箱內(nèi)控制溫度(26～30 ℃)和濕度(30%～50%)以及足夠的光照(光暗比為12 h:12 h)以保持蜥蜴健康的日常生活。另外，蜥蜴每天喂食2次活的黃粉蟲(Tenebriomolitor)，并且每2天清除一次它們的排泄物。

1.4 劑量選擇和實驗設(shè)計

由于對爬行動物的毒理學(xué)研究較少，爬行動物的風險評估通常用鳥類來替代[17]。腈菌唑?qū)B類的急性毒性LD50為498(408～598, 95% C.I.) mg·kg-1，被歸類為中等有毒物。在預(yù)實驗中，使用5 mg·kg-1的腈菌唑暴露對蜥蜴體重造成顯著影響，但未觀察到有蜥蜴死亡。因此，本實驗選擇腈菌唑?qū)B類急性毒性LD50的大約1%(5 mg·kg-1)作為蜥蜴的暴露濃度。

在實驗之前，將所有雄性蜥蜴(n=12)分為3組(每組n=4)，包括1個對照組和2個試驗組。分組后的蜥蜴飼養(yǎng)在實驗玻璃箱(30 cm×30 cm×20 cm)中，飼養(yǎng)條件與1.3中提到的相同。2個試驗組中的蜥蜴根據(jù)體重分別經(jīng)口暴露5 mg·kg-1的MT1和MT2，對照組僅施用溶劑(玉米油+乙醇)暴露，每周暴露2次，連續(xù)暴露4周。在第1、7、14和28天分別測量3組蜥蜴的體重。暴露結(jié)束后，3組蜥蜴全部處死，立即收集蜥蜴肝臟并冷凍于-20 ℃，留待進一步分析。

1.5 肝組織病理學(xué)分析

收集得到的蜥蜴肝組織切下一小部分并儲存于4%的多聚甲醛中用于組織病理學(xué)分析。將肝組織包埋在石蠟中，切成矢狀切片(約5 μm)，用蘇木精-伊紅(H&E)染色，然后通過光學(xué)顯微鏡進行觀察。

1.6 RNA分離和cDNA合成

使用TrizolA+試劑(購自北京天根生化科技有限公司)從蜥蜴的肝臟中提取總RNA。然后，使用Nanodrop ND-2000分光光度計測量總RNA的濃度和OD260/OD280的比率，用于隨后的cDNA克隆。

嚴格按照FastKing RT試劑盒(含gDNase)(購自北京天根生化科技有限公司)的說明書反轉(zhuǎn)錄大約2 μg的總RNA。首先，加入總RNA和2 μL 5×gDNA Buffer，接下來加入RNase-Free ddH2O使其體積補足10 μL，在42 ℃溫育3 min，然后在冰上冷卻。加入含有2 μL 10×King RT Buffer, 1 μL FastKing RT Enzyme Mix, 2 μL FQ-RT Primer Mix和5 μL RNase-Free ddH2O的混合液至最終體積為20 μL。在42 ℃溫育15 min，95 ℃加熱3 min使逆轉(zhuǎn)錄失活，反應(yīng)結(jié)束。

1.7 實時定量PCR

使用Talent qPCR PreMix(SYBR Green)(購自北京天根生化科技有限公司)試劑盒進行實時定量PCR，實時定量儀的型號為MX3005P (Stratagene, USA)，反應(yīng)總體積為20 μL。反應(yīng)包括擴增階段和解離階段。擴增階段程序為：95 ℃、3 min，接下來是95 ℃、5 s和60 ℃、32 s并循環(huán)40次。解離階段程序為：95 ℃、40 s，60 ℃、40 s和95 ℃、40 s。本研究中選擇的類固醇合成相關(guān)基因及其引物分別列于表1。β-Actin基因的引物序列參考之前的研究[5]，其他引物由作者使用Primmer Primmer 5.0軟件(Canada)設(shè)計。在這項研究中，使用管家基因β-Actin來標定mRNA的表達?；虻奶禺愋詳U增通過熔解曲線(僅一個峰)來分析確認。為減少蜥蜴?zhèn)€體間的基因表達差異，本實驗設(shè)置4個生物學(xué)平行，所有樣品均重復(fù)測試3次，使用△△Ct方法進行結(jié)果分析。

表1 定量PCR中基因表達所需引物序列Table 1 Primers used for quantitative PCR measurement of gene expression

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有數(shù)據(jù)均通過SPSS 22.0軟件進行分析，并使用Levene's檢驗數(shù)據(jù)方差的均一性。采用ANOVA方法分析對照組與暴露組之間差異。*P<0.05、**P<0.01表示具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果(Results)

2.1 蜥蜴體重變化

實驗期間，記錄了對照組和暴露組蜥蜴在1,7,14和28 d的體重的變化(見表2)。在實驗期間蜥蜴沒有出現(xiàn)中毒癥狀或死亡。與對照組相比，MT2暴露組蜥蜴在所有記錄點的體重均無明顯變化。然而，MT1暴露組的蜥蜴體重在28 d 時出現(xiàn)顯著下降，在其記錄點沒有觀察到顯著變化。說明MT1和MT2對蜥蜴體重的影響不同，MT1暴露對蜥蜴體重的影響更明顯。

2.2 肝組織病理學(xué)

在28 d暴露結(jié)束后，觀察到了蜥蜴的肝組織病理學(xué)變化(圖1)。在對照組中，正常的蜥蜴肝組織細胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列(圖1A)。與對照組相比，暴露組中均觀察到肝細胞的不同程度病變。例如，在MT1暴露后，肝組織細胞出現(xiàn)了細胞核聚集的現(xiàn)象并伴隨著不同程度的炎癥(圖1B)。而在MT2暴露后，觀察到了肝組織細胞的脂肪化(圖1C)。

2.3 代謝相關(guān)基因表達

對照組蜥蜴肝臟代謝相關(guān)基因的表達如表3所示。相對于管家基因β-Actin的表達，CYP3A4和CYP3A7基因的表達是管家基因的18倍左右。CYP2D6和CYP2D3基因的表達也超過了管家基因，分別是管家基因的3.96倍和2.31倍。而CYP1A1和CYP2C8基因的表達卻低于管家基因，分別是管家基因的0.86倍和0.59倍。由此可知，CYP3A4和CYP3A7是蜥蜴肝臟含量最為豐富的CYP450代謝酶。

圖1 雄性蜥蜴的肝組織切片注：(A)對照組；(B)MT1暴露組；(C)MT2暴露組。Fig. 1 Liver sections of male lizardsNote: (A) the control; (B) MT1 treated group; (C) MT2 treated group.

濃度/(mg·kg-1)Concentration/(mg·kg-1)分組Group體重/gBody weight/g1 d7 d14 d28 d55CK(對照)4.48±0.134.25±0.114.05±0.114.28±0.08MT14.28±0.114.15±0.153.88±0.133.70±0.12?MT24.33±0.114.08±0.083.95±0.154.23±0.23

注：數(shù)據(jù)以平均值±方差的形式表示；星號表示與對照組相比有顯著差異(*P<0.05)；MT1表示(+)-腈菌唑，MT2表示(-)-腈菌唑。

Note： The data was expressed as mean±S.E.; asterisks indicate significant difference compared to the control (*P<0.05); MT1 and MT2 are two enantiomers; MT1 stands for (+)- myclobutanil, and MT2 stands for (-)- myclobutanil.

腈菌唑手性單體對蜥蜴肝臟代謝相關(guān)基因表達的影響如圖2所示。由圖可知：MT1暴露對CYP1A1的基因表達沒有明顯影響，而在MT2暴露時，CYP1A1基因受到顯著抑制，表達量為對照組的41.36%(P<0.05)；在MT1和MT2暴露下，CYP3A4、CYP3A7和CYP2D3的基因表達雖有變化，但都不顯著(P>0.05)；CYP2D6基因表達在MT1暴露下變化不大，而在MT2暴露下出現(xiàn)了顯著上調(diào)(P<0.05)；特別的，CYP2C8基因表達在MT1暴露下顯著上調(diào)(P<0.05)，在MT2暴露下卻出現(xiàn)了顯著下調(diào)(P<0.05)，這可能與手性單體間的對映選擇性有關(guān)。

圖2 MT1和MT2對雄性蜥蜴代謝相關(guān)基因表達的影響注：* 代表處理組與對照組差異顯著(P<0.05)。Fig. 2 Effects of MT1 and MT2 on the expression of metabolic related genes in male lizardNote: * represents significant difference between treated and control groups (P<0.05).

基因GeneCPY1A1CYP2D6CYP3A4CYP3A7CYP2C8CYP2D3相對表達倍數(shù)Relative expression fold0.86±0.073.96±0.7517.96±3.1918.08±3.850.59±0.142.31±0.62

3 討論(Discussion)

體重的變化是評價蜥蜴成長的重要指標[18]。在本研究中，經(jīng)過28 d的暴露，觀察到MT1暴露組的蜥蜴體重顯著下降(P<0.05)，而MT2暴露組蜥蜴體重雖有變化，但不顯著(P>0.05)。與MT1暴露結(jié)果類似，50 mg·kg-1氟蟲脲暴露也能造成繁殖階段的蜥蜴體重發(fā)生顯著下降[19]。體重的減輕對蜥蜴的代謝、生長、發(fā)育和繁殖都有著一定影響。因此，與MT2相比，MT1暴露對蜥蜴正常生長影響更大。

盡管MT2暴露對蜥蜴的體重影響不大，但蜥蜴的肝臟還是觀察到了細胞的脂肪化(圖1C)。這可能是肝組織細胞面對外源物質(zhì)入侵的一種應(yīng)激反應(yīng)，造成肝細胞脂質(zhì)攝取增加而脂肪氧化減少,導(dǎo)致肝細胞內(nèi)脂肪蓄積，肝臟肥大。之前研究也發(fā)現(xiàn)，在高劑量的腈菌唑、丙環(huán)唑和三唑酮暴露下，出生后92 d的雄性大鼠肝臟細胞均出現(xiàn)了細胞肥大現(xiàn)象[4]。在MT1暴露組觀察到蜥蜴肝組織細胞核聚集，這可能是MT1誘導(dǎo)的產(chǎn)物在肝細胞中聚集，占據(jù)了大量的細胞空間，細胞核被推到了細胞邊緣。與之相似，麗斑麻蜥在苯霜靈單體暴露后，其肝組織切片也觀察到了細胞核聚集現(xiàn)象[20]。由此可見，腈菌唑的2個單體對蜥蜴的肝組織均造成一定程度的損傷，這將影響肝臟的正常代謝功能。

在脊椎動物中，唑類殺真菌劑可以調(diào)節(jié)CYP酶活性[21]。唑類可以通過與血紅素鐵相互的作用對CYP酶的活性進行誘導(dǎo)或抑制[22]。例如，之前研究表明咪唑類酮康唑和克霉唑是CYP3A4的有效抑制劑[22-23]。然而，克霉唑的重復(fù)暴露反而對CYP3A4又產(chǎn)生了誘導(dǎo)[22]。在本研究中，MT2顯著抑制了蜥蜴CYP1A1的表達，而MT1對CYP1A1基因的表達沒有明顯的影響，說明腈菌唑不同單體對蜥蜴同一基因的表達影響不同。腈菌唑手性單體對麗斑麻蜥代謝相關(guān)基因的影響是具有手性選擇性的。這種對映選擇差異也可以在CYP2C8基因的表達中明顯觀察到：MT1暴露顯著抑制了CYP2C8的表達，而MT2暴露卻顯著誘導(dǎo)了CYP2C8的表達。一般來說，手性對映體是有立體選擇性的，其對生物體的影響可能完全不同[24]。之前研究發(fā)現(xiàn)手性農(nóng)藥暴露對水生生物毒性也有類似的對映選擇效應(yīng)[6,25-26]。CYP3A亞族是促成人肝微粒體中主要藥物代謝(> 60%)的最豐富的CYP酶之一[27]。同樣的，在本研究中我們發(fā)現(xiàn)CYP3A4和CYP3A7也是麗斑麻蜥肝臟中含量最為豐富的CYP450代謝酶。然而，無論MT1還是MT2暴露，CYP3A4和CYP3A7的基因表達都沒有發(fā)生明顯變化。在CYP2D亞族中，MT1暴露下CYP2D6和CYP2D3的基因表達未發(fā)生明顯變化；而在MT2暴露下，CYP2D6基因的表達出現(xiàn)明顯上調(diào)，CYP2D3基因的表達仍未發(fā)生明顯變化。這說明同一CYP亞族基因間的表達在不同腈菌唑單體暴露下也是有差異的。通常，抑制CYP亞型基因表達能夠降低由該特定亞型代謝底物的代謝和肝臟清除，而誘導(dǎo)CYP酶基因表達可以導(dǎo)致底物的代謝和肝臟清除增加[28]。因此，蜥蜴體內(nèi)CYP代謝相關(guān)酶基因的表達變化也從一定層面上反映著MT1和MT2對蜥蜴肝臟代謝的影響。由以上結(jié)果可知，不同腈菌唑單體對蜥蜴體重、肝組織病理學(xué)以及代謝相關(guān)基因的表達影響不同，具有一定的對應(yīng)選擇性。

致謝：感謝中科院生態(tài)環(huán)境研究中心郭寶元副研究員對實驗和文章的指導(dǎo)。