張曉鳳 ，田 耘 ，程小紅，趙亞峰，劉建紅，張 鵬 ，張 宇，宋阿苗，徐長青

1陜西省中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710003；2咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院

間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一類具有自我更新、多系分化和高度增殖的細胞，近年來人們逐漸將其應(yīng)用于多種疾病的治療［1］。目前越來越多的研究證實，移植后MSCs旁分泌功能是其發(fā)揮治療作用的主要機制。Dzau最早證實MSCs以旁分泌方式發(fā)揮心肌損傷修復(fù)作用［2］。研究發(fā)現(xiàn)，將MSCs移植到腎間質(zhì)纖維化的動物模型中，MSCs通過分泌各種細胞因子促進腎小管周圍細胞增殖，減輕炎癥反應(yīng)，抑制細胞凋亡，參與腎臟結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)，抑制腎間質(zhì)的纖維化［3］。上述研究雖然證實了移植后MSCs以旁分泌功能抑制腎間質(zhì)纖維化，并為臨床治療腎間質(zhì)纖維化提供了新的思路，但是MSCs移植后生存率低，細胞移入后旁分泌能力差仍是目前MSCs移植領(lǐng)域尚未解決的難題［4］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，腎復(fù)康Ⅱ號對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠具有減少轉(zhuǎn)化生長因子 β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）和纖溶酶原激活物抑制劑1（plasminogen activator inhibitor 1，PAI-1）表達，促進肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白 -7（bone morphogenetic protein 7，BMP-7）增殖和生長的作用［5-6］。又有研究顯示HGF及其受體c-Met是調(diào)控MSCs旁分泌功能的重要因子，可以通過影響多種細胞因子，如TGF-β1、α平滑肌肌動蛋白等抑制腎間質(zhì)纖維化［7］。結(jié)合上述研究結(jié)果，我們采用腎復(fù)康Ⅱ號聯(lián)合MSCs移植的方法嘗試解決改善MSCs旁分泌作用的科學(xué)難題。本研究采用將腎復(fù)康Ⅱ號聯(lián)合MSCs移植、腎復(fù)康Ⅱ號聯(lián)合NK4拮抗MSCs表面的HGF后再移植的方法，觀察MSCs的旁分泌作用，為揭示腎復(fù)康Ⅱ號對MSCs的旁分泌調(diào)控作用與機制提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 腎復(fù)康Ⅱ號 嚴格按照我院院內(nèi)制劑制備工藝執(zhí)行（陜藥制字Z20130011）：將山茱萸120 g、山藥（炒）80 g粉碎成細粉，將菟絲子120 g，熟地黃 80 g，金櫻子 96 g，淫羊藿 80 g，丹參 120 g，赤芍 96 g，姜黃 96 g，黃芪 120 g，王不留行 120 g，鱉甲（醋制）120g加水煎煮2次，2 h/次，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為 1.32～1.38（60～65℃）的稠膏，加入上述細粉、混勻、干燥、粉碎，用75%的乙醇制成顆粒，干燥即可。

1.1.2 動物 雄性1周齡SD大鼠3只，體質(zhì)量約25 g，制備MSCs；雄性體質(zhì)量約250 g成年SD大鼠50只制備動物模型。購自西安交通大學(xué)動物中心，實驗動物合格證號：SCXK（陜）2016-0816。

1.1.3 儀器與試劑 二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo Scientific 公司，批號：3131），L-DMEM 培養(yǎng)基、進口胎牛血清（美國Gibco公司，批號31600034，1616000-084），HGF鼠單抗、C-Met鼠單抗（英國Abcam公司，批號：201616，201689）、NK4 蛋白轉(zhuǎn)染質(zhì)粒（長沙贏潤生物技術(shù)有限公司，批號：2016100412），反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR real-time PCR試劑盒（日本 Takala 公司，批號：1621，1689）等。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組 隨機將50只SD大鼠分為模型組、生理鹽水組+MSCs移植組（生理鹽水+MSCs組）、生理鹽水組+NK4拮抗HGF表達的MSCs組（生理鹽水+拮抗劑組）、腎復(fù)康Ⅱ號+MSCs移植組（腎復(fù)康Ⅱ號+MSCs組）、腎復(fù)康Ⅱ號+NK4拮抗HGF表達的MSCs組（腎復(fù)康Ⅱ號+拮抗劑組）。應(yīng)用不同藥物混懸液預(yù)處理，分別給予生理鹽水灌胃、腎復(fù)康Ⅱ號混懸液灌胃，1次/d，共14天。

1.2.2 M SCs的分離、純化和培養(yǎng) 1周齡雄性SD大鼠3只，頸椎脫臼處死，75%乙醇浸泡消毒，于超凈臺中無菌條件下分離股骨、脛骨，剪去兩側(cè)骨骺端，吸引無血清培養(yǎng)基沖出骨髓，反復(fù)數(shù)次，每分鐘1 000 rpm，離心5分鐘，棄上清；在細胞沉淀中加入10%胎牛血清培養(yǎng)基，制成單細胞懸液，以1×106/cm2的密度接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，置于 5%CO2，37℃孵箱中培養(yǎng)，常規(guī)換液、傳代［8］。

1.2.3 造模方法 大鼠腎間質(zhì)纖維化模型的制備采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎法［4］。造模后1天，模型組尾靜脈注射生理鹽水1 mL，其余各組尾靜脈注射 2×106/100 μL 的 MSCs。

1.2.4 PCR檢測N K 4拮抗M SCs H G F的表達 用TRIzol裂解各組細胞，提取總RNA。測量RNA濃度，用紫外分光光度計進行RNA濃度測量。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用SYBR real-time PCR試劑盒配置20μL反應(yīng)體系。將配置的PCR反應(yīng)溶液置于Real-time RNA儀進行熒光定量PCR實驗。

1.2.5 PCR檢測H G F及C-M et的表達 移植后4周，頸椎脫臼處死大鼠，分離雙側(cè)腎臟，將腎組織勻漿后備用。應(yīng)用Trizol法提取大鼠腎臟總RNA，實時定量-逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)進行基因片段擴增并定量。PCR反應(yīng)各管所加模板RNA量約為2 μg。通過Real-time RNA儀進行熒光定量PCR實驗，Ct值對起始模板相對定量。

1.2.6 W est ern bl ot檢測H G F及C-M et的表達 腎組織勻漿后用Trizol法提取蛋白，進行蛋白定量，電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)移至NC膜上，分別加入特異性抗體、二抗?jié)舛葹?∶1000，快速化學(xué)發(fā)光法顯影，多色熒光凝膠成像系統(tǒng)定量掃描光密度，以β-actin為參照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0醫(yī)學(xué)統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學(xué)處理，定量資料采用（±s）表示，采用t檢驗，以P＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 N K 4拮抗 M SCs H G F、c-M et的表達 應(yīng)用NK4蛋白轉(zhuǎn)染質(zhì)粒干預(yù)MSCs，轉(zhuǎn)染24小時后進行實時定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)HGF拮抗劑NK4可抑制MSCs的HGF表達，見圖1。

2.2 H G F及c-M et的表達 移植后4周，Western blot結(jié)果顯示，腎復(fù)康Ⅱ號+MSCs組較其余各組腎組織HGF及c-Met均明顯增高，腎復(fù)康Ⅱ號+MSCs組升高最明顯，其次為腎復(fù)康Ⅱ號+拮抗劑組、生理鹽水+MSCs組，見圖2。

圖1 2組N K 4拮抗M SCs H G F、c-M et的表達

圖2 各組大鼠移植后H G F及c-M et的表達

2.3 H G F及c-M et的表達 移植后4周，實時定量PCR結(jié)果顯示，腎復(fù)康Ⅱ號+MSCs組較其余各組腎組織HGF及c-Met均明顯增高，腎復(fù)康Ⅱ號+拮抗劑組與生理鹽水+MSCs組腎組織HGF及c-Met升高程度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組腎組織中的H G F、c-M et m RN A的表達（±s） β-act i n

表1 各組腎組織中的H G F、c-M et m RN A的表達（±s） β-act i n

注：*表示與模型組比較，P＜0.05

組別 H G F c-M et模型組 1.20±0.21 1.20±0.14生理鹽水+拮抗劑組 1.29±0.18 1.36±0.12生理鹽水+M SCs組 1.66±0.11 1.65±0.12腎復(fù)康Ⅱ號+拮抗劑組 1.76±0.13 1.67±0.14腎復(fù)康Ⅱ號+M SCs組 1.94±0.07* 1.93±0.12*

3 討論

慢性腎臟病具有發(fā)病率高、病程進展快、醫(yī)療費用高等特點，嚴重危害人類健康［9］。慢性腎臟病的主要病理特征是腎臟纖維化，腎臟纖維化是多種腎臟疾病發(fā)展至終末期腎功能衰竭的共同通路。因此，要延緩慢性腎臟病的進展，勢必以防治腎臟纖維化作為突破口［10］。

間充質(zhì)干細胞因其具有自我更新、多系分化、高度增殖、易于分離培養(yǎng)擴增、移植時不存在組織配型、無免疫排斥及倫理問題等特性，逐漸成為細胞移植和組織工程中的理想種子細胞［1］。研究認為MSCs定向分化為新的組織細胞替代受損組織是其發(fā)揮治療作用的主要方式［3］。2005年MSCs旁分泌功能的證實［2］，使越來越多的觀點認為移植后MSCs旁分泌細胞因子是其發(fā)揮治療作用的主要機制［4］。多數(shù)觀點認為，MSCs歸巢至受損組織以旁分泌方式起作用抑制腎間質(zhì)纖維化是發(fā)揮治療作用的主要機制。目前，有文獻報道的MSCs分泌的細胞因子中，HGF被證實在調(diào)控MSCs旁分泌功能抑制腎間質(zhì)纖維化中起重要作用。HGF通常由間質(zhì)來源的細胞分泌，可作用于數(shù)種上皮起源的細胞，誘導(dǎo)其進行有絲分裂、刺激細胞移動，并促進其入侵細胞基質(zhì)［11］。HGF與受體c-Met結(jié)合引起酪氨酸激酶活化，激活細胞內(nèi)多個信號級聯(lián)反應(yīng)［12］。HGF拮抗劑中最具代表性的是NK4。NK4與c-Met結(jié)合可以競爭性的完全抑制HGF和c-Met的相互作用，從而抑制HGF所誘導(dǎo)的細胞增殖、運動和形態(tài)生成［13］。

然而，MSCs治療過程中旁分泌能力差是影響其療效的瓶頸問題。雖然，近年來已進行了很多有關(guān)改善MSCs歸巢和旁分泌功能的研究，如基因轉(zhuǎn)染、誘導(dǎo)細胞因子表達等［14］，但是都未能完全解決影響移植后MSCs療效的根本問題。因此，國內(nèi)不少學(xué)者應(yīng)用中藥單體或復(fù)方聯(lián)合MSCs移植的方法提高MSCs的旁分泌作用［15-16］。

腎纖維化屬中醫(yī)“腎勞”范疇，我科在臨床治療腎纖維化過程中提出腎陽虛損，痰瘀互結(jié)為其基本病機，以益腎散結(jié)立法，組方腎復(fù)康Ⅱ號，干預(yù)腎間質(zhì)纖維化的進展，已取得了較滿意的療效。近年來我們對該方進行的相關(guān)實驗研究證實，腎復(fù)康Ⅱ號具有改善UUO大鼠腎功能，減少TGF-β1和PAI-1的表達，促進HGF、BMP-7表達，上調(diào)MSCs分泌的HGF的表達，提示該方具有促進MSCs分泌抗纖維化因子抑制腎纖維化的作用［17］。

因此，本研究發(fā)現(xiàn)腎復(fù)康Ⅱ號聯(lián)合NK4抑制MSCs-HGF表達后再移植，在腎組織中仍能分泌HGF蛋白，證明腎復(fù)康Ⅱ號具有促進MSCs在體內(nèi)分泌HGF的作用，從而驗證了腎復(fù)康Ⅱ號對植入的MSCs具有旁分泌功能，并部分揭示了其調(diào)控機制。本實驗為臨床應(yīng)用腎復(fù)康Ⅱ號協(xié)助MSCs移植抑制腎間質(zhì)纖維化提供了研究基礎(chǔ)。今后，還可能為闡明中藥益腎散結(jié)配伍的科學(xué)內(nèi)涵提供實驗依據(jù)。