鄭繁榮 呂鵬飛 唐沖 侯曉飛 張昆 劉正 張清華 栗劍 張光武

北京大學(xué)首鋼醫(yī)院骨科，北京 100144

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)的特征表現(xiàn)為骨量降低，骨微結(jié)構(gòu)破壞，骨強(qiáng)度下降及骨折風(fēng)險(xiǎn)增加[1]。骨質(zhì)疏松癥包括原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥和繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥。原發(fā)性O(shè)P分為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)、老年骨質(zhì)疏松癥(senile osteoporosis，SOP)和特發(fā)性骨質(zhì)疏松癥(idiopathic osteoporosis，IOP)。其中SOP為70歲以后發(fā)生的骨質(zhì)疏松癥，又稱為Ⅱ型骨質(zhì)疏松癥。人口老齡化已出現(xiàn)在全球許多國(guó)家，我國(guó)亦不例外。相關(guān)資料顯示，2014年，中國(guó)60歲上的老年人口已突破2億，預(yù)計(jì)到2050年左右老年人口將達(dá)到全國(guó)人口總數(shù)的1/3。而相關(guān)資料統(tǒng)計(jì)顯示，SOP及其引發(fā)的骨質(zhì)疏松性骨折(osteoporotic fracture，OF)數(shù)量高于心腦血管病及乳腺癌的總和。SOP除了危害老年人的身體健康之外，還嚴(yán)重影響其心理，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和社會(huì)負(fù)擔(dān)，故全社會(huì)應(yīng)高度重視SOP及其引發(fā)的問題。

研究SOP的相關(guān)機(jī)制對(duì)預(yù)防SOP及OF的發(fā)生具有重要意義。SOP及OF的發(fā)生由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用所致，其中遺傳因素決定了60%～80%的峰值骨量。自Morrison等[2]于1994年首次提出應(yīng)用維生素D受體等位基因預(yù)測(cè)骨密度(bone mineral density，BMD)之后，各國(guó)學(xué)者相繼發(fā)現(xiàn)許多其他候選基因。Hegarty等[3]于近期發(fā)現(xiàn)乳腺癌雌激素調(diào)控基因1(growth regulation by estrogen in breast cancer 1，GREB1)的基因多態(tài)性與高加索人群骨密度相關(guān)，而目前國(guó)內(nèi)尚未有針對(duì)該基因與骨量或骨折風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性研究。故本文就GREB1基因rs10929757、rs5020877位點(diǎn)多態(tài)性與SOP的相關(guān)性進(jìn)行研究，對(duì)該基因與OF風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1一般資料：研究對(duì)象來自 2016 年1月至2017 年7月北京大學(xué)首鋼醫(yī)院骨科病房、老年干部病房的226例患者。骨折組(骨質(zhì)疏松性骨折)100例，均為椎體骨折患者，其中男性37例，女性63例；年齡70～94歲，平均(76.190±5.208)歲。對(duì)照組(無骨質(zhì)疏松同時(shí)無骨折)126例，其中男性46例，女性80例；年齡70～90歲，平均(75.318±4.300)歲。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.1.2納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥診療指南，腰椎或髖部1處及以上部位T≤-2.5SD則定義為骨質(zhì)疏松。T≤-2.5SD且發(fā)生骨折的患者為骨折組。腰椎或髖部所有部位T均>-2.5SD的患者為對(duì)照組，兩組患者年齡≥70歲；理解本研究的目的及要求并簽署知情同意書。

1.1.3排除標(biāo)準(zhǔn)：伴隨嚴(yán)重合并癥；合并影響骨代謝疾病，包括甲狀旁腺功能亢進(jìn)、甲狀旁腺功能減退、垂體疾病等；近1年應(yīng)用雙膦酸鹽類藥物；近6個(gè)月使用影響骨代謝藥物，包括骨化三醇、雌激素、活性維生素D、降鈣素、類固醇激素等。

1.2 研究方法

1.2.1骨密度測(cè)定：受試者取仰臥位，應(yīng)用雙能X線骨密度儀(QDR-4500；Hologic，Inc.，Waltham，MA，USA)測(cè)量髖部和腰椎骨密度值。

1.2.2SNP分型：所有患者清晨空腹時(shí)采集靜脈血2 mL，置于EDTA 抗凝管中，存于-80 ℃冰箱等待提取DNA。外周血白細(xì)胞DNA提取采用酚/氯仿法，提取后存于-20 ℃冰箱。IGF-1基因rs2229765、rs35767位點(diǎn)引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。rs10929757位點(diǎn)上游引物：5′-GCATCTAGGTGGTAGCCGAG-3′，下游引物：5′-GCTCACACCTCAGGGAAAGC-3′；rs5020877位點(diǎn)上游引物：5′-TCTCTCTTTCAGGAGCACTTTC-3′，下游引物：5′-AGAAAGATTCAGCCTTTCCTCT-3′。應(yīng)用Snapshot技術(shù)進(jìn)行基因分型。核心反應(yīng)體系包擴(kuò)測(cè)序酶、熒光標(biāo)記的 ddNTP、緊挨多態(tài)位點(diǎn)5′-端不同長(zhǎng)度的延伸引物、包含SNP位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物模板。通過反應(yīng)，引物延伸一個(gè)堿基即終止，再經(jīng)測(cè)序儀檢測(cè)，根據(jù)峰的移動(dòng)位置確定該延伸產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的SNP位點(diǎn)，根據(jù)峰的顏色可得知摻入的堿基種類，從而確定該樣本的基因型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的基本情況

兩組研究對(duì)象在性別、年齡和體質(zhì)量指數(shù)上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩組各部位BMD值比較，骨折組均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見表1。

表1 兩組患者一般情況比較

2.2 兩組患者在rs10929757位點(diǎn)等位基因頻率和基因型頻率比較

兩組患者等位基因和基因型均符合遺傳學(xué)Hardy-Weinberg定律(P>0.1)。骨折組C、A等位基因頻率分別為49.0%、51.0%，對(duì)照組C、A等位基因頻率分別為51.6%、48.4%，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。骨折組CC、CA、AA基因型頻率分別為23.0%、52.0%、25.0%，對(duì)照組CC、CA、AA基因型頻率分別為23.8%、55.6%、20.6%，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 兩組男性患者在rs10929757位點(diǎn)等位基因頻率和基因型頻率比較

兩組男性患者等位基因和基因型均符合遺傳學(xué)Hardy-Weinberg定律(P>0.1)。骨折組C、A等位基因頻率分別為36.5%、63.5%，對(duì)照組C、A等位基因頻率分別為52.2%、47.8%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。骨折組CC、CA、AA基因型頻率分別為13.5%、45.9%、40.5%，對(duì)照組CC、CA、AA基因型頻率分別為28.3%、47.8%、23.9%，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 兩組女性患者在rs10929757位點(diǎn)等位基因頻率和基因型頻率比較

兩組女性患者等位基因和基因型均符合遺傳學(xué)Hardy-Weinberg定律(P>0.1)。骨折組C、A等位基因頻率分別為56.3%、43.7%，對(duì)照組C、A等位基因頻率分別為51.2%、48.8%，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。骨折組CC、CA、AA基因型頻率分別為28.6%、55.6%、15.9%，對(duì)照組CC、CA、AA基因型頻率分別為21.3%、60.0%、18.8%，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.5 兩組患者在rs5020877位點(diǎn)等位基因頻率和基因型頻率比較

兩組患者等位基因和基因型均符合遺傳學(xué)Hardy-Weinberg定律(P>0.1)。骨折組G、A等位基因頻率分別為6.9%、93.1%，對(duì)照組G、A等位基因頻率分別為6.3%、93.7%，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。由于GG基因型僅有1例，且GA型少于AA型，故將GG型與GA型合并計(jì)算。骨折組GG+GA、AA基因型頻率分別為12.0%、88.0%，對(duì)照組GG+GA、AA基因型頻率分別為11.9%、88.1%，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.6 兩組男性患者在rs5020877位點(diǎn)等位基因頻率和基因型頻率比較

兩組男性患者等位基因和基因型均符合遺傳學(xué)Hardy-Weinberg定律(P>0.1)。骨折組G、A等位基因頻率分別為10.1%、89.9%，對(duì)照組G、A等位基因頻率分別為7.0%、93.0%，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。骨折組GG+GA、AA基因型頻率分別為16.2%、83.8%，對(duì)照組GG+GA、AA基因型頻率分別為13.0%、87.0%，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.7 兩組女性患者在rs5020877位點(diǎn)等位基因頻率和基因型頻率比較

兩組女性患者等位基因和基因型均符合遺傳學(xué)Hardy-Weinberg定律(P>0.1)。骨折組G、A等位基因頻率分別為5.0%、95.0%，對(duì)照組G、A等位基因頻率分別為6.0%、94.0%，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。骨折組GG+GA、AA基因型頻率分別為9.5%、90.5%，對(duì)照組GG+GA、AA基因型頻率分別為11.3%、88.7%，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.8 rs10929757位點(diǎn)不同基因型患者骨密度比較

在rs10929757位點(diǎn)，總體、男性和女性患者中不同基因型患者骨密度值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

2.9 rs5020877位點(diǎn)不同基因型患者骨密度比較

在rs5020877位點(diǎn)，總體、男性和女性患者中不同基因型患者骨密度值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表2 rs10929757位點(diǎn)不同基因型患者骨密度比較(g/cm2)

表3 rs5020877位點(diǎn)不同基因型患者骨密度比較(g/cm2)

3 討論

據(jù)估計(jì)，2010年中國(guó)在OF的花費(fèi)接近100億美元，預(yù)計(jì)2035年增加1倍，而2050年將達(dá)到254億美元[4]。并且OF患者術(shù)后仍有較高的再骨折風(fēng)險(xiǎn)[5]。因此，應(yīng)積極研究OP和OF的發(fā)生機(jī)制，并對(duì)其危險(xiǎn)因素進(jìn)行干預(yù)，以降低OF造成的相關(guān)醫(yī)療費(fèi)用。種族、高齡、絕經(jīng)后女性、OF家族史為OP的不可控危險(xiǎn)因素，不健康的生活方式、體質(zhì)量指數(shù)過低等為可控危險(xiǎn)因素。為盡可能減少混雜因素干擾，本研究納入患者年齡均大于70歲，并人為控制性別比例及體質(zhì)量指數(shù)，使兩組研究對(duì)象具有可比性。臨床上將BMD檢查作為診斷OP的金標(biāo)準(zhǔn)，已有大量研究證實(shí)了相關(guān)基因與BMD的相關(guān)性[6-7]。故本研究以BMD檢查結(jié)果分組，將全身1處及以上部位出現(xiàn)T≤-2.5SD且發(fā)生骨折的患者定為骨折組，將全身無1處部位出現(xiàn)T≤-2.5SD且無骨折的患者定為對(duì)照組。

國(guó)內(nèi)外許多研究顯示，女性在絕經(jīng)后發(fā)生OP及OF的風(fēng)險(xiǎn)隨絕經(jīng)年限增加而呈現(xiàn)出明顯增高的趨勢(shì)[8-9]。雌激素水平是女性BMD的主要影響因素。正常女性BMD在30歲左右達(dá)到峰值，在圍絕經(jīng)期平緩下降；而在絕經(jīng)后，由于雌激素水平明顯降低，使得成骨細(xì)胞活性絕對(duì)下降，破骨細(xì)胞活性相對(duì)增強(qiáng)，于是血鈣水平明顯增加。在負(fù)反饋?zhàn)饔孟?，甲狀旁腺激素的分泌受到抑制。由于維生素 D 的內(nèi)分泌系統(tǒng)主要受甲狀旁腺激素調(diào)節(jié)，故維生素 D的合成隨之受到影響[10-11]。而維生素D作為影響鈣離子吸收的因素之一[12]，其降低將造成鈣離子在消化道內(nèi)吸收減少，進(jìn)一步造成骨形成減少，骨吸收增加，導(dǎo)致BMD迅速下降。隨著絕經(jīng)年限的增加，機(jī)體各臟器功能亦逐漸減弱，細(xì)胞衰老造成雌激素分泌逐年減少，進(jìn)一步減少維生素D和鈣離子的吸收，骨吸收和骨形成失衡愈發(fā)顯著，發(fā)生OF的概率隨即增加[13]。因此，鑒于絕經(jīng)后女性為OP的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，本研究亦根據(jù)性別進(jìn)行了亞組分析。

GREB1基因是一種激素反應(yīng)性基因，亦為雄激素、雌激素信號(hào)通路中常見的靶基因[14]。該基因定位于2p25.1，由雌激素誘導(dǎo)產(chǎn)生作用，并直接由雌激素受體調(diào)控其表達(dá)[15]。在雌激素受體陽性的乳腺癌細(xì)胞中，GREB1的表達(dá)與月經(jīng)周期內(nèi)的雌激素水平密切相關(guān)[16]。GREB1基因的cDNA有至少3個(gè)不同的非編碼5’端外顯子，而這些外顯子的轉(zhuǎn)錄依賴雌激素的調(diào)控，提示存在多個(gè)雌激素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。GREB1亦可調(diào)控雄激素，雄激素受體反應(yīng)元件又可促進(jìn)GREB1的表達(dá)，而抑制GREB1可阻斷雄激素所誘導(dǎo)的組織生長(zhǎng)[17]。雌激素和雄激素都可調(diào)節(jié)骨重建使骨結(jié)構(gòu)保持完整。

Hegarty等[3]對(duì)477個(gè)無血緣關(guān)系的絕經(jīng)后女性的研究發(fā)現(xiàn)，在rs10929757位點(diǎn)，A等位基因頻率為38%，A等位基因攜帶者具有更高的股骨頸部BMD值。本研究中，在rs10929757位點(diǎn)，在總研究對(duì)象中和男性人群中，發(fā)現(xiàn)骨折組A等位基因頻率均大于對(duì)照組。此外，在兩組男性患者的比較中，骨折組為63.5%，對(duì)照組為47.8%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組患者在總體和各亞組中各基因型比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在總體、男性和女性患者中分別比較該位點(diǎn)不同基因型患者BMD值，發(fā)現(xiàn)男性A等位基因攜帶者具有更低的全髖部和腰椎部BMD值，而女性A等位基因攜帶者具有更高的全髖部BMD值，女性AA型具有更高的腰椎BMD值，但以上結(jié)果均無明顯差異，這可能與樣本量少有關(guān)。本研究說明老年男性在rs10929757位點(diǎn)A等位基因攜帶者椎體OF風(fēng)險(xiǎn)更高，該基因位點(diǎn)多態(tài)性存在性別差異和種族差異。

Hegarty等[3]同時(shí)對(duì)來自229個(gè)家庭的508個(gè)成員的研究發(fā)現(xiàn)，在rs5020877位點(diǎn)，G等位基因頻率為9%，G等位基因攜帶者具有更高的腰椎和股骨頸部BMD值。本研究中除男性骨折組的G等位基因頻率(10.1%)以外，其余均低于Hegarty研究的結(jié)果。兩組患者在總體和亞組中GG、GA基因型和AA型的比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在總體、男性和女性患者中分別比較該位點(diǎn)不同基因型患者BMD值，發(fā)現(xiàn)G等位基因攜帶者無論男女均具有較高的髖部BMD值，女性G等位基因攜帶者具有更高的腰椎BMD值，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，增加樣本量可能出現(xiàn)顯著區(qū)別。因此，本研究未發(fā)現(xiàn)rs5020877位點(diǎn)基因多態(tài)性與老年OF相關(guān)。

綜上所述，本研究提示老年男性在rs10929757位點(diǎn)A等位基因攜帶者椎體OF風(fēng)險(xiǎn)更高，未發(fā)現(xiàn)rs5020877位點(diǎn)多態(tài)性與老年OF的相關(guān)性。然而，本研究具有以下局限性：首先，樣本量較小，代表性不足，未能進(jìn)行家系研究進(jìn)一步證實(shí)相關(guān)性，這可能是造成某些陰性結(jié)果的原因；其次，未能綜合比較不同骨折類型、合并癥、生活方式、環(huán)境以及雌激素水平等因素；此外，GREB1基因影響骨量的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明。因此，下一步需擴(kuò)大樣本量，并進(jìn)行更廣泛和深入的研究，進(jìn)一步探討OP的發(fā)生機(jī)制，為預(yù)防OF提供理論基礎(chǔ)。