肖志鋒 林定坤,* 何劍波 蘇國義 侯宇 陳樹東

1. 廣州中醫(yī)藥大學-嶺南醫(yī)學研究中心中醫(yī)骨傷科實驗室，廣東 廣州 510405 2. 廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州 510120

腰痛和神經(jīng)放射性疼痛是椎間盤退變(intervertebral disc degeneration，IVDD)的主要臨床癥狀[1-2]，嚴重的IVDD常導致脊柱不穩(wěn)或殘疾，給人類帶來巨大的痛苦和沉重的社會經(jīng)濟負擔[3]。然而，目前還沒有有效的方法來修復退變的椎間盤，進一步明確IVDD的關鍵病理機制和開發(fā)有效的治療藥物仍是急需解決的問題。

終板是椎體和椎間盤錨定的過渡結構，是椎體與椎間盤聯(lián)系的橋梁，椎間盤營養(yǎng)的供給主要通過上、下終板從椎體中獲取[4-6]。在循環(huán)壓力載荷下終板的液體流動是椎間盤攝取營養(yǎng)和排泄廢物的主要方式[7-8]。椎體骨質(zhì)疏松(osteoporosis，OP)時骨髓的微環(huán)境改變和終板骨化導致的骨髓運輸通道阻塞減少可能會誘使和加重IVDD。有證據(jù)表明OP參與IVDD過程，絕經(jīng)后婦女椎體OP與其發(fā)生IVDD相關[9-10]，同時荷爾蒙水平可以影響IVDD的嚴重程度[10-12]。然而一部分研究顯示OP可以增加終板的滲透性從而延緩IVDD，二者是負相關的[8,13-14]。因此，椎體OP是否直接影響IVDD，椎體代謝如何影響到椎間盤仍不明確。本研究通過評估OVX小鼠的脊柱微病變，包括椎體、終板及椎間盤，進一步明確絕經(jīng)后椎體OP是否可導致IVDD以及其作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和實驗設計

30只8周齡SPF級健康C57BL/6 J雌性小鼠，購于廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心[SCXK (粵) 2013-0034]，飼養(yǎng)于22 ℃～25 ℃，40%～60%相對濕度環(huán)境下，晝夜交替，自由飲食。適應性飼養(yǎng)3 d后小鼠隨機分為CT組(Control組)和OVX組(OVX組)，每組15只。兩組分別行假手術和雙側(cè)卵巢摘除，之后每周記錄小鼠的體重變化。造模12周后處死小鼠，獲取L4/5脊柱節(jié)段用于后續(xù)實驗。本實驗通過廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心倫理委員會倫理審查，按照實驗動物使用和關懷指導原則進行。

1.2 Micro-CT分析

獲取L4/5脊柱節(jié)段，立即浸入4%多聚甲醛溶液中4 ℃固定72 h，樣本用PBS沖洗3次，每次15 min，待測。根據(jù)Bian等[15]報道的方法，脊柱樣本(n=6)用于高分辨率Micro CT掃描(Skyscan1172)。簡要過程如下：掃描參數(shù)設定為電壓59 kv，電流100 μA，層厚9 μm；掃描圖片分別使用NRecon v1.6軟件和CTAn v1.9軟件進行重建和分析，使用CTvox v3.0軟件進行三維圖像重建。L4/5的冠狀面三維圖像用于終板及椎間盤的形態(tài)分析。應用CTAn v1.9軟件定義椎體、終板、椎間盤的感興趣區(qū)，200層連續(xù)感興趣區(qū)于椎體的三維重建，椎間盤感興趣區(qū)定義為L4/5椎體間不可見區(qū)域。終板定義為覆蓋在椎體表面的可見骨性結構。

1.3 組織病理學和免疫組織化學檢測

L4/5節(jié)段脊柱(n=9)浸入10%的中性EDTA(PH=7.4)溶液中常溫脫鈣14 d，流水沖洗4 h后，梯度脫水并石蠟包埋，樣本進行4 μm冠狀面切片，之后進行番紅O-固綠染色以及免疫組織化學染色。番紅O-固綠染色根據(jù)說明書操作(賽維爾公司，武漢)，免疫組織化學染色根據(jù)Abcam/Santa Cruz 標準操作流程進行。簡要過程如下：切片脫蠟，水化，EDTA(PH=8.0)抗原修復液中微波加熱至沸騰20 min，冷卻至室溫，3%H2O2處理10 min 阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，山羊血清封閉常溫封閉15 min，一抗 Col2 (Abcam，ab34712，1∶200)，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)(Santa Cruz，sc-7269，1∶200) 4 ℃孵育過夜。陰性對照組用PBS孵育。免疫組化步驟根據(jù)北京中杉金橋公司PV-6001免疫組化二步法操作流程進行，DAB顯色后，蘇木素復染細胞核15 s，黃棕色代表陽性。免疫熒光實驗，切片避光孵育Alexa Fluor?555標記熒光二抗(CST Corporation，USA，#4409) 1 h，DAPI染核10 min，利用顯微鏡進行觀察和拍照(Olympus DP80，Japan)。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 OVX小鼠的大體觀，子宮形態(tài)、重量及體重變化

大體觀顯示OVX組小鼠腹腔內(nèi)可見大量脂肪堆積(圖1 A，空心箭頭)；實驗結果顯示，CT組和OVX組小鼠體重隨時間不斷增加，而OVX組體重增加較CT組更為明顯(圖1 B)。同時出現(xiàn)明顯的子宮萎縮，重量減輕，與CT組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(*P<0.05)(圖1C、D)。

圖1 OVX對小鼠體重及子宮的影響。A、B：小鼠大體形態(tài)和重量(空心箭頭指示腹腔脂肪堆積)；C、D：子宮形態(tài)和重量

2.2 OVX小鼠L4/5脊柱節(jié)段椎體、終板微結構及椎間盤體積變化

Micro-CT結果顯示OVX組小鼠骨小梁明顯稀疏、變細(圖2 A)，骨小梁結構參數(shù)顯示OVX組小鼠L4椎體骨體積分數(shù)(BV/TV)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)以及骨小梁連接密度(Conn.Dn)與CT組相比明顯降低(*P<0.05)，而骨小梁變異系數(shù)(Tb.pf)及模型指數(shù)(structure model index，SMI)明顯升高(*P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁間距(Tb.sp)及開放性孔隙率[Po(op)]兩組間差異無統(tǒng)計學意義，但OVX組小鼠骨小梁在Tb.sp 和 Po(op)上有上升趨勢(圖2)。同時，OVX組小鼠終板中出現(xiàn)明顯骨化重塑，終板表面孔隙增加(圖3，箭)，伴隨著椎間盤間隙變窄，體積減少，與CT組相比差異具有統(tǒng)計學意義(*P<0.05)，(圖3)。

圖2 OVX對小鼠骨微結構和參數(shù)的影響。A：骨微結構；B：孔隙率；C：骨體積百分比；D：骨小梁數(shù)量；E：骨小梁厚度；F：骨小梁間距；G：骨小梁變異系數(shù)；H：骨小梁連接密度；I：模型指數(shù)

2.3 OVX小鼠椎間盤的病理改變

病理結果顯示CT組椎間盤形態(tài)結構正常，椎間盤髓核組織中大量脊索細胞被大量細胞外基質(zhì)包繞，終板為大量軟骨細胞組成的透明軟骨(圖4 A、C)。OVX組小鼠出現(xiàn)明顯的IVDD，可見髓核減少、基質(zhì)降解和形態(tài)結構紊亂(圖4B，箭頭)；番紅O-固綠染色可見終板被染成與骨組織相同的深綠色，表明蛋白多糖丟失(圖4B)；可見終板骨化和增厚，出現(xiàn)髓腔(圖4D，雙向箭頭)，軟骨潮線不斷上移(圖4D，箭頭)及表面靠近髓核的軟骨終板不斷變薄、活性細胞不斷減少(圖4D)。

2.4 OVX小鼠椎間盤中Col2、VEGF的表達

免疫組織化學結果顯示，與CT組相比，OVX組小鼠椎間盤中Col2表達明顯降低，尤其在終板骨化重塑區(qū)和外層纖維環(huán)丟失明顯(圖5，箭頭)。免疫熒光顯示VEGF在OVX小鼠椎間盤終板中顯著升高(圖6，箭頭)，有趣的是OVX小鼠終板中Col2降低的區(qū)域與VEGF升高的區(qū)域基本一致，這預示著二者是相互影響的致病因素，無血管椎間盤終板的骨化重塑和血管新生可能是IVDD的重要環(huán)節(jié)。

圖3 OVX對終板結構及椎間盤體積的影響(箭頭示終板孔隙及微結構改變)

圖4 OVX小鼠椎間盤的番紅O-固綠染色。A：CT組小鼠椎間盤形態(tài)結構基本正常；B：OVX組小鼠椎間盤可見明顯退變，形態(tài)結構紊亂，終板明顯骨化增厚；C和D：終板局部高倍放大圖

圖5 OVX小鼠椎間盤中Col2的表達。A、B：終板；C、D：髓核；E、F：纖維環(huán)。箭頭指示終板和纖維環(huán)中Col2表達顯著降低

圖6 OVX小鼠椎間盤VEGF的表達(箭頭指示VEGF表達)

3 討論

OP和IVDD是最為常見的脊柱退行性疾病，臨床上它們常相互伴隨，然而它們間的相互關系卻不明確。本研究顯示小鼠卵巢切除可導致椎體OP、終板骨化重塑和肥大、孔隙增加，從而導致IVDD。終板中Col2表達降低伴隨VEGF表達明顯升高，表明異常的終板骨化和血管新生參與OP介導的IVDD過程。

既往研究顯示，年齡、性別、肥胖、遺傳、免疫、營養(yǎng)、炎癥、機械力、損傷等多種因素均參與IVDD進程[14，16]。然而不論何種因素，IVDD是一個脊柱功能單位(包括相鄰的結構如椎體、終板、韌帶等)退變的過程[5-6，11]。椎間盤作為無血管組織，其代謝和力學主要受椎體及終板的影響，因此椎體及終板病變(如OP)可能是誘發(fā)椎間盤緩慢發(fā)生退變的起始因素。一些研究顯示椎體OP時牽張應力的改變與多節(jié)段IVDD增高的許莫氏結節(jié)發(fā)生率相關[17]。此外，磁共振成像椎體終板下骨信號改變可以作為活動性IVDD的評判標準[18]。作為椎間盤與椎體間物質(zhì)交換和生物力學傳導的橋梁，終板的結構和功能完整是影響椎間盤的關鍵因素[19-20]，而終板界面結構的損壞可能是引起力學和生物因素惡性循環(huán)，推進IVDD進展的中心環(huán)節(jié)。一些研究發(fā)現(xiàn)，OP時終板的骨化重塑引起終板孔隙及滲透性降低而促進OP介導的IVDD過程[6]，相反另一些研究顯示OP可以增加終板孔隙和滲透性延緩IVDD[8]，這些結論基于椎間盤主要依賴終板從椎體獲取營養(yǎng)。然而本研究顯示椎體OP、終板骨軟骨重塑引起終板孔隙及滲透性增加促使了IVDD的發(fā)生，這可能與終板孔隙滲透增加導致抗原暴露、免疫炎癥反應及椎間盤髓核內(nèi)壓逐漸丟失有關。有研究顯示骨保護素基因敲除后OP小鼠椎間盤出現(xiàn)血管新生及炎癥因子增加，預示著OP誘導了椎間盤的血管侵入和炎癥反應[21]。此外，終板的Modic改變與腰痛關系密切[5，22]，伴隨有終板Modic改變的人群IVDD更為嚴重。OP人群髓核更易于突入終板發(fā)生IVDD，終板損傷亦可造成正常的髓核內(nèi)壓不能維持進而導致蛋白多糖的降解丟失促使IVDD[23]，這些證據(jù)說明OP及終板損害是造成IVDD的不可或缺的因素。

Col2是軟骨組織中含量最豐富的物質(zhì)，它的含量對正常椎間盤功能尤為重要[24]，本研究結果顯示OVX后小鼠椎間盤中Col2表達減弱，特別在終板骨化重塑區(qū)和外層纖維環(huán)。同時相應區(qū)域的VEGF顯著上升，說明OP介導的終板骨化重塑、終板滲透性的增高和血管新生不是為椎間盤提供更多的營養(yǎng)，而是促使Col2的降解以及椎間盤的纖維化和退變?？傊狙芯匡@示雌激素缺乏OP是造成IVDD的不利因素，椎體、終板結構的完整是椎間盤正常生理機能的保障。作為發(fā)揮“生物半透膜”功能的終板，只有完整的結構，合適的終板滲透性，才能在保證椎間盤正常的營養(yǎng)需求的同時又避免對椎間盤內(nèi)微環(huán)境的干擾，以及維持髓核適當?shù)臐B透內(nèi)壓，確保椎間盤的代謝和功能。