趙增成 ， 李桂明 ， 宋敏訓(xùn) ， 李 穎 ， 楊世發(fā) ， 黃中利 ， 馮敏燕 ， 傅 劍 ， 林樹(shù)乾

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所 ， 山東濟(jì)南250023)

銀連解毒口服液是我們研發(fā)的新獸藥，由金銀花、連翹、薄荷、荊芥、牛蒡子、竹葉、甘草等組成。功效為辛涼解表，清熱解毒，可用于家禽溫?zé)峒膊〉姆乐?。因處方中，薄荷、荊芥含有揮發(fā)油成分，且具有重要的生物活性，因此先采用共水蒸餾法對(duì)薄荷、荊芥進(jìn)行了揮發(fā)油提取，提取后的藥渣與剩余藥味再進(jìn)行煎煮水提。為了篩選出最佳的提取工藝參數(shù)，對(duì)提取工藝中的最重要影響因素加水量、浸泡時(shí)間、提取時(shí)間、提取次數(shù)進(jìn)行了篩選研究。

1 材料與方法

1.1 儀器 島津高效液相色譜儀、AB265-S型雙量程十萬(wàn)分之一電子天平、KQ5200DB型超聲儀、揮發(fā)油測(cè)定器。

1.2 藥品與試劑 綠原酸對(duì)照品、牛蒡苷對(duì)照品，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。各中藥飲片，購(gòu)自濟(jì)南宏濟(jì)堂藥店。乙腈為色譜純?cè)噭状?、磷酸均為分析純?cè)噭?/p>

1.3 揮發(fā)油提取工藝篩選 為了篩選出薄荷、荊芥中揮發(fā)油的最佳提取條件，提高揮發(fā)油提取率，采用單因素試驗(yàn)對(duì)影響揮發(fā)油提取率的主要因素提取時(shí)間、加水量、浸泡時(shí)間進(jìn)行考察。

1.3.1 加水量的考察 按處方比例，稱(chēng)取薄荷60 g、荊芥40 g，共100 g，分別加入6倍、8倍、10倍量的水，用揮發(fā)油測(cè)定器進(jìn)行蒸餾，提取5 h，記錄出油量。

1.3.2 浸泡時(shí)間的考察 稱(chēng)取薄荷60 g、荊芥40 g，共100 g，加入8倍量的水，分別浸泡0.5 h、1 h、2 h，用揮發(fā)油測(cè)定器進(jìn)行蒸餾，提取5 h，記錄出油量。

1.3.3 提取時(shí)間的考察 稱(chēng)取薄荷60 g、荊芥40 g共100 g，用揮發(fā)油測(cè)定器進(jìn)行蒸餾，分別在開(kāi)始回流后的不同時(shí)間，記錄出油量。

1.4 中藥浸泡時(shí)間篩選 中藥的浸泡時(shí)間與吸水率對(duì)提取有一定的影響，但中藥的浸泡一般按完全浸透為原則。取處方量的中藥飲片1 000 g，加入6倍量的水浸泡，每間隔0.5 h，觀(guān)察1次浸潤(rùn)程度，并將水過(guò)濾盡，稱(chēng)量濕藥重量，計(jì)算吸水率，記錄吸水率達(dá)到飽和的時(shí)間。

吸水率=(藥材濕重-藥材干重)/藥材干重×100%

1.5 煎煮工藝篩選 在確定了藥材浸泡時(shí)間后，采用正交試驗(yàn)對(duì)本品煎煮工藝進(jìn)行了篩選研究，選定加水量、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)3個(gè)因素，以干膏量、綠原酸含量和牛蒡苷含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)最佳提取工藝進(jìn)行優(yōu)選。

1.5.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取中藥加水量(A)、煎煮時(shí)間(B)、煎煮次數(shù)(C) 3個(gè)因素，進(jìn)行3因素3水平篩選試驗(yàn)，因素水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。選用正交表L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[1-2]，共進(jìn)行9組試驗(yàn)，正交試驗(yàn)方案見(jiàn)表2。

1.5.2 試驗(yàn)方法 按處方比例稱(chēng)取相同的中藥飲片共9份，每份1 000 g，其中薄荷、荊芥取蒸餾后的藥渣，按表2試驗(yàn)條件分別進(jìn)行煎煮，濾過(guò)，煎煮液最后濃縮至1 g/mL。

表1 煎煮工藝因素水平表

表2 煎煮工藝正交試驗(yàn)

取蒸發(fā)皿9個(gè)，105 ℃干燥至恒重，精密稱(chēng)定其重量。分別精密吸取所制備的9份中藥濃縮液各10 mL至上述蒸發(fā)皿中，水浴蒸至近干，置105 ℃干燥3 h，轉(zhuǎn)移至干燥器中冷卻0.5 h，精密稱(chēng)定，所得重量減去蒸發(fā)皿重量，即得干膏重量。

分別對(duì)制備的9份中藥濃縮液，按制定的銀連解毒口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案，以高效液相色譜法(HPLC)對(duì)綠原酸、牛蒡苷含量進(jìn)行測(cè)定。

1.5.3 綠原酸含量測(cè)定 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.4%磷酸溶液(13∶87)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm。理論板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算應(yīng)不低于1 000。

對(duì)照品溶液的制備：取綠原酸對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成每毫升含40 μg的溶液，即得(10 ℃以下保存)。

供試品溶液的制備：精密量取本品2 mL，置50 mL 棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，超聲20 min，搖勻，即得。

測(cè)定法：分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

1.5.4 牛蒡苷含量測(cè)定 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn):以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈-0.4%磷酸溶液(25∶75)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為277 nm，理論板數(shù)按牛蒡苷峰計(jì)算應(yīng)不低于1 000。

對(duì)照品溶液的制備：取牛蒡苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每毫升含0.6 mg 的溶液，即得(10℃以下保存)。

供試品溶液的制備：精密量取本品5 mL，置50 mL 棕色量瓶中，加甲醇至刻度，超聲20 min，混勻。

測(cè)定法：分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀中，測(cè)定，即得。

1.5.5 統(tǒng)計(jì)方法 以干膏量、綠原酸含量、牛蒡苷含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)定三者的加權(quán)系數(shù)分別為0.4、0.3、0.3，采用綜合加權(quán)評(píng)分法，計(jì)算出各次試驗(yàn)的綜合評(píng)分。具體評(píng)分方法：以干膏重量最大的1次試驗(yàn)判為100分，按照每次試驗(yàn)干膏量與最大干膏量的比例，計(jì)算各自干膏量指標(biāo)中的得分。同法，分別計(jì)算每次試驗(yàn)的綠原酸和牛蒡苷含量得分。最后按照3項(xiàng)指標(biāo)的加權(quán)系數(shù)，計(jì)算出各次試驗(yàn)的綜合評(píng)分。

根據(jù)綜合評(píng)分結(jié)果，采用極差法進(jìn)行最佳因素排序，并得出最優(yōu)組合。采用方差分析，得出各因素對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)的顯著影響程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)油提取結(jié)果

2.1.1 不同加水量揮發(fā)油提取結(jié)果 加水量對(duì)揮發(fā)油提取量具有一定的影響，加8倍量水時(shí)，揮發(fā)油提取量最多。詳見(jiàn)表3。

表3 不同加水量薄荷、荊芥揮發(fā)油累計(jì)提取量 (mL)

2.1.2 不同浸泡時(shí)間揮發(fā)油提取結(jié)果 中藥浸泡時(shí)間對(duì)揮發(fā)油提取量影響不明顯，本著節(jié)約時(shí)間和提高效率的原則，浸泡時(shí)間確定為0.5 h。見(jiàn)表4。

2.1.3 不同蒸餾時(shí)間揮發(fā)油提取結(jié)果 試驗(yàn)表明，加熱蒸餾1 h內(nèi)出油最快，且已基本提盡，綜合考慮能源的節(jié)約，提取時(shí)間選擇為蒸餾1 h。見(jiàn)表5。

表4 不同浸泡時(shí)間薄荷、荊芥中揮發(fā)油累計(jì)提取量 (mL)

表5 不同時(shí)間薄荷、荊芥中揮發(fā)油提取量

2.2 藥材浸泡時(shí)間及吸水率考察結(jié)果 不同浸泡時(shí)間藥材的吸水率情況，見(jiàn)表6。

表6 不同浸泡時(shí)間藥材吸水率

由表6可知，當(dāng)浸泡2 h時(shí)，吸水已達(dá)到飽和狀態(tài)，此時(shí)藥材已完全浸透，吸水率為 220% ，因此確定藥材最佳浸泡時(shí)間為2 h。

2.3 煎煮工藝正交試驗(yàn)結(jié)果 正交試驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)表7，方差分析結(jié)果見(jiàn)表8。

表7 正交試驗(yàn)結(jié)果

表8 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

極差直觀(guān)分析結(jié)果表明，影響因素大小為C>A>B，即煎煮次數(shù)>加水量>煎煮時(shí)間。優(yōu)選條件為A3B3C3。

方差分析結(jié)果表明，A(加水量)、B(煎煮時(shí)間)、C因素(煎煮次數(shù))對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)均具有顯著影響(P<0.05)。

綜合分析以上結(jié)論，最佳工藝參數(shù)選擇為：加水量為10倍藥量，煎煮時(shí)間為1.5 h，共煎煮3次。

3 討論

3.1 本試驗(yàn)確定出了處方藥物薄荷、荊芥的揮發(fā)油最佳提取工藝，即將中藥飲片加8倍量水，浸泡0.5 h，蒸餾提取1 h，可取得最佳的提取效益。

3.2 通過(guò)浸泡試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，綜合考慮干膏量、綠原酸含量、牛蒡苷含量3項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)，將最佳煎煮工藝確定為：加水量為10倍藥量，浸泡2 h，每次煎煮1.5 h，共煎煮3次。

3.3 薄荷、荊芥中含有大量的揮發(fā)油成分，現(xiàn)代研究表明，揮發(fā)油具有抗炎、抗病毒、抑菌、解熱鎮(zhèn)痛等作用[3-4]，是不可缺少的有效成分，發(fā)揮著重要的治療作用。但揮發(fā)油有非常強(qiáng)的揮發(fā)性，且水溶解性較差，不能大量溶解于水[5-6]。如果將薄荷、荊芥與其他的藥物放在一起直接煎煮，揮發(fā)油成分就可能全部損失掉，嚴(yán)重影響藥物的療效。因此，將薄荷、荊芥采用了先單獨(dú)提取揮發(fā)油的生產(chǎn)工藝。

3.4 本制劑中金銀花清熱解毒、辛涼透表為主藥，牛蒡子疏散風(fēng)熱、解毒利咽為臣藥。金銀花的主要活性成分為綠原酸，牛蒡子的主要活性成分為牛蒡苷，它們均是重要的生物活性物質(zhì)，具有抗菌、抗病毒等作用[7-8]，因此將綠原酸、牛蒡苷含量作為工藝篩選的評(píng)價(jià)指標(biāo)。