任向陽 ， 吳文福 ， 岑小清 ， 劉秋燕 ， 游啟有 ， 賴月輝

(1.廣東永順生物制藥股份有限公司 ， 廣東廣州510623 ； 2.廣州出入境檢驗檢疫局 ， 廣東廣州510623)

豬瘟是由豬瘟病毒(CSFV)引起的豬的一種危害嚴重的烈性傳染病，其特征為小血管的變性導致組織器官的多發(fā)性出血、壞死和梗死[1]。豬瘟嚴重危害我國養(yǎng)豬業(yè)并造成巨大的經(jīng)濟損失。疫苗免疫接種是我國預(yù)防控制豬瘟的主要措施[2-3]。采用牛睪丸原代細胞生產(chǎn)的豬瘟活疫苗對當時我國的豬瘟防控起到了重要作用。但因受到牛睪丸來源不均一、生產(chǎn)工藝不穩(wěn)定等因素影響，導致生產(chǎn)的豬瘟活疫苗批間差異大、質(zhì)量不穩(wěn)定，且存在外源病毒污染的風險[4]。采用豬睪丸(ST)傳代細胞生產(chǎn)豬瘟活疫苗在生產(chǎn)工藝、疫苗純凈性、病毒含量和質(zhì)量穩(wěn)定性等方面取得了顯著突破[4-5]。本試驗對豬睪丸(ST)細胞作為豬瘟活疫苗生產(chǎn)用細胞基質(zhì)的可行性進行了探討。試驗方法和結(jié)果報告如下。

1 材料

1.1 試驗細胞 豬睪丸(ST)細胞系，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供，廣東永順生物制藥股份有限公司傳代、鑒定和保存。

1.2 對照細胞 陽性對照細胞：鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞C6(18)。陰性對照細胞：鼠成纖維細胞NIH3T3。

1.3 試驗用仔豬 來源于廣東永順生物制藥股份有限公司實驗動物場自繁自養(yǎng)的CSFV、PRV、PRRSV、PCV2、PPV抗原陰性且未接種過CSF疫苗的二元雜交仔豬。經(jīng)豬瘟中和試驗方法檢測，選擇豬瘟中和抗體陰性的25～30日齡健康易感仔豬。

1.4 攻毒用強毒 豬瘟強毒石門系血毒，由廣東永順生物制藥股份有限公司制備、鑒定和保存。

2 方法

2.1 ST細胞系的培養(yǎng) 取ST細胞經(jīng)胰酶-EDTA細胞消化液消化傳代，以MEM生長液或維持液置36 ℃～37 ℃培養(yǎng)，形成良好單層時，用于繼續(xù)傳代或接種病毒。

2.2 ST細胞系的檢驗

2.2.1 純凈性檢驗 將ST基礎(chǔ)細胞庫細胞復蘇，傳代至F3作為待檢細胞，記作ST(F3)細胞。復蘇ST工作細胞庫細胞，連續(xù)傳代至F5、F10、F15、F20、F25和F30作為待檢細胞，分別記作ST(F5)、ST(F10)、ST(F15)、ST(F20)、ST(F25)和ST(F30)細胞。觀察不同代次待檢細胞的生長特性，并按現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》對待檢細胞進行細菌、真菌、支原體和外源病毒檢驗[6]。

2.2.2 致瘤性試驗 取處于對數(shù)生長期的ST(F3)、ST(F5)、ST(F10)、ST(F15)、ST(F20)、ST(F25)和ST(F30)待檢細胞和NIH3T3陰性對照細胞分別用PBS稀釋成5×107/mL細胞懸液，每組分別接種裸鼠10只，每只背部皮下注射0.2 mL(含107個細胞)。取處于對數(shù)生長期的C6陽性對照細胞用PBS稀釋成5×106/mL的細胞懸液，接種裸鼠10只，每只背部皮下注射0.2 mL(含106個細胞)。連續(xù)觀察14日，檢查有無結(jié)節(jié)或腫瘤形成。如果有結(jié)節(jié)或可疑病灶，繼續(xù)觀察1周，然后剖檢，進行病理組織學檢查。對未發(fā)生結(jié)節(jié)的動物，取其中半數(shù)裸鼠觀察3周剖檢，對另外半數(shù)裸鼠觀察12周后剖檢，觀察各淋巴結(jié)和內(nèi)臟器官中有無結(jié)節(jié)形成，對疑似者進行病理組織學檢查。斷頸處死裸鼠后，立即取瘤組織，經(jīng)10% 福爾馬林固定，制成石蠟切片。按照常規(guī)方法進行蘇木素-伊紅染色并觀察結(jié)果。

2.2.3 胞核學檢驗 取對數(shù)生長期的ST(F3)、ST(F10)、ST(F20)和ST(F30)細胞分別加入Colchicine 0.2 μg/mL培養(yǎng)液，37 ℃作用3～7 h。D-Hank′s 洗一次，0.25% Trypsin消化，D- Hank′s洗一次，0.075M KCl 37 ℃低滲15 min，甲醇：乙酸(3∶1)固定3～4次，離心后少量固定液懸浮細胞，滴片，60 ℃干燥過夜，Giemsa染色10 min，水洗并空氣干燥，二甲苯透明，封片。每組細胞分別觀察50個處于有絲分裂中期細胞的染色體數(shù)。

2.3 ST細胞系繁殖豬瘟病毒的增殖試驗 取處于對數(shù)生長期的ST(F5)、ST(F10)、ST(F15)、ST(F20)、ST(F25)和ST(F30)細胞，按3%接毒量分別接種同一批豬瘟毒種，接毒后5日作第一次收獲換液，之后每隔4日收獲換液1次。取一收至五收毒液分別用家兔測定其效價。將毒液用滅菌生理鹽水作5×105倍稀釋，每個稀釋度分別接種家兔2只，每只耳靜脈注射1.0 mL。接種后家兔體溫反應(yīng)標準與結(jié)果判定參考現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》。

2.4 ST細胞系繁殖的豬瘟病毒的免疫原性試驗 取處于對數(shù)生長期的ST(F5)、ST(F15)、ST(F20)和ST(F30)細胞，按3%接毒量分別接種同一批豬瘟種毒，接毒后5日作第一次收獲換液，之后每隔4日收獲換液1次。將一收至五收的混合毒液用滅菌生理鹽水作2×105倍稀釋，分別接種無豬瘟中和抗體的25～30日齡健康易感仔豬5頭，每頭耳后頸部肌肉注射1.0 mL。接種14日后，連同5頭條件相同的非免疫對照仔豬分別攻擊豬瘟強毒，每頭頸部肌肉注射豬瘟石門系血毒1.0 ml/頭(含105MLD)。攻毒后每天觀察臨床癥狀，每天上、下午各測體溫一次，連續(xù)觀察16天，并統(tǒng)計分析攻毒結(jié)果。

3 結(jié)果與分析

3.1 生長特性觀察及純凈性檢驗結(jié)果 ST(F3)、ST(F5)、ST(F10)、ST(F15)、ST(F20)、ST(F25)和ST(F30)細胞在pH值7.0～7.2的MEM營養(yǎng)液中，置37 ℃，含5% CO2條件下培養(yǎng)24～72 h，均可長成良好單層。經(jīng)顯微鏡觀察，上述各代次ST細胞長成良好單層時，均附著貼壁生長，折光性強，形態(tài)規(guī)則，細胞透明度大，沒有空泡和融合細胞。上述各代次細胞經(jīng)檢驗均沒有細菌、真菌、支原體和外源病毒污染。

3.2 致瘤性試驗結(jié)果 ST(F3)、ST(F5)、ST(F10)、ST(F15)、ST(F20)、ST(F25)、ST(F30)待檢細胞和NIH3T3陰性對照細胞接種裸鼠觀察21日均未出現(xiàn)結(jié)節(jié)或腫瘤形成(結(jié)果見表1)；取其中一半裸鼠于細胞接種后3周進行剖檢觀察，各淋巴結(jié)和器官均未出現(xiàn)結(jié)節(jié)或腫瘤形成；取另外一半裸鼠于細胞接種后12周進行剖檢觀察，各個淋巴結(jié)和器官均未發(fā)現(xiàn)結(jié)節(jié)或腫瘤的形成，也無移植瘤形成。而C6細胞接種的10只裸鼠，在接種2周后在其頸背皮下均可以觀察到黃豆粒大小的腫瘤，隨著時間的延長，腫瘤逐漸變大。取該瘤組織觀察，可見瘤組織質(zhì)韌、切面呈灰白色肉樣。將瘤組織經(jīng)福爾馬林固定、制成石蠟切片進行H.E.染色后鏡檢，可見瘤組織內(nèi)血管豐富，瘤細胞呈梭形，排列紊亂，核分裂旺盛，伴有異型核及病理性核分裂。

表1 各組細胞致瘤性試驗結(jié)果

3.3 胞核學檢驗結(jié)果 經(jīng)試驗觀察，在基礎(chǔ)細胞庫中存在的染色體標志，在ST(F10)、ST(F20)和ST(F30)細胞中均找到，ST(F10)、ST(F20)和ST(F30)細胞中的染色體模式數(shù)均未高于ST(F3)的15%(結(jié)果見表2)。上述結(jié)果符合生產(chǎn)用細胞系胞核學檢驗結(jié)果。

表2 不同代次ST細胞的胞核學檢驗結(jié)果

3.4 ST細胞系繁殖豬瘟病毒的增殖試驗結(jié)果 取對數(shù)生長期的ST(F5)、ST(F10)、ST(F15)、ST(F20)、ST(F25)和ST(F30)細胞，按3%接毒量分別接種同一批豬瘟種毒，上述每個代次ST細胞繁殖的一收至五收細胞毒液效價均可達到5×105RID/mL(結(jié)果見表3)。

3.5 ST細胞系繁殖的豬瘟病毒的免疫原性試驗結(jié)果 取處于對數(shù)生長期的ST(F5)、ST(F15)、ST(F20)和ST(F30)細胞為基質(zhì)制備的豬瘟病毒分別接種無豬瘟中和抗體的健康易感豬5頭，接種后未見任何不良反應(yīng)，接種部位未出現(xiàn)腫塊，免疫豬對豬瘟強毒的保護率均為100%(5/5)，免疫豬的精神、食欲、體溫均無異常(結(jié)果見表4)。對照豬發(fā)病率100%(5/5)，均呈現(xiàn)典型的豬瘟臨床癥狀，且有4頭豬死亡，剖檢均可見豬瘟特征性病變。

表3 不同代次ST細胞繁殖豬瘟病毒的增殖試驗結(jié)果

表4 不同代次ST細胞繁殖的豬瘟病毒的免疫原性試驗結(jié)果

4 結(jié)論

4.1 生物制品使用細胞基質(zhì)的安全性一直是WHO關(guān)心的問題[7]。采用傳代細胞系生產(chǎn)豬瘟活疫苗，應(yīng)更加注重其傳代穩(wěn)定性和安全性。豬睪丸(ST)細胞系經(jīng)過嚴格而全面的鑒定，并建立了基礎(chǔ)細胞庫和工作細胞庫，安全純凈。 相對于采用牛睪丸原代細胞培養(yǎng)豬瘟病毒，減少了牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒(BVD/MDV)等外源因子污染生產(chǎn)基質(zhì)的可能。豬瘟兔化弱毒在ST細胞經(jīng)過反復繁殖馴化試驗，已研究出最適培養(yǎng)系統(tǒng)、培養(yǎng)工藝，確定了培養(yǎng)基的要求、細胞接毒劑量、收獲時間和收獲次數(shù)等技術(shù)參數(shù)。豬瘟病毒已適應(yīng)于在ST細胞上繁殖。

4.2 ST細胞系在傳代過程中形態(tài)良好，分裂能力強，無致瘤性且染色體遺傳穩(wěn)定。取不同代次的ST細胞繁殖豬瘟病毒液并測定其毒液效價；取不同代次的ST細胞繁殖的豬瘟病毒分別對豬進行免疫攻毒并測定其免疫原性。結(jié)果表明，將ST工作細胞傳至第30代，其仍能良好地表達豬瘟病毒，產(chǎn)毒穩(wěn)定，病毒滴度高，連續(xù)收毒，病毒產(chǎn)量高，且其所表達的豬瘟病毒仍保持良好的免疫原性。上述結(jié)果表明，豬睪丸(ST)細胞系傳代穩(wěn)定且安全，利用其制備的豬瘟病毒效價高且具有良好的免疫原性，符合豬瘟活疫苗生產(chǎn)用細胞基質(zhì)的要求。

4.3 ST細胞系在傳代過程中具有良好的生物學穩(wěn)定性和純凈性，且以ST細胞系為生產(chǎn)基質(zhì)繁殖的豬瘟病毒效價高并具有良好的免疫原性，為生產(chǎn)安全高效的豬瘟活疫苗提供了新的技術(shù)支撐。采用ST細胞系生產(chǎn)豬瘟活疫苗，生產(chǎn)效率高，生產(chǎn)工藝穩(wěn)定；疫苗病毒含量明顯提高，批間差異小，質(zhì)量可控；疫苗安全性好，大大減少了免疫接種的應(yīng)激反應(yīng)；疫苗免疫效力好，可以減少母源抗體和其他病毒的混合感染對豬瘟活疫苗的免疫干擾作用；疫苗免疫效果確實，高水平的細胞免疫和體液免疫水平可以防止免疫豬的持續(xù)帶毒，使豬瘟從源頭得到控制[8-10]。