張學(xué)勇 ， 簡瑩娜 ， 李秀萍 ， 王戈平 ， 蔡其剛 ， 王光華 ， 馬利青

(1.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院 省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室 ， 青海西寧810016 ；2.青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院 ， 青海西寧810016)

寵物犬作為現(xiàn)代生活中重要的伴侶動物，越來越受到人們的喜愛，但是犬的疾病特別是腹瀉疾病及其引起的其他癥狀，嚴(yán)重時可導(dǎo)致犬死亡，嚴(yán)重危害養(yǎng)犬業(yè)的健康發(fā)展；同時，犬?dāng)y帶的一些人獸共患性病原，隨著犬的活動及其與人們的親密接觸，也是一個重要的公共衛(wèi)生問題，所以有必要對其主要病原進(jìn)行有效的確診鑒定。目前，雖然臨床上治療犬腹瀉的藥物很多，但是多數(shù)情況下卻簡單采用抗生素類藥物治療，有時不能做到有效治療；同時獸醫(yī)臨床中缺少必要的實驗室診斷方法，不能準(zhǔn)確診斷出致病性的各種病原。引起犬腹瀉的主要病原有細(xì)菌性病原、病毒和寄生蟲病原，細(xì)菌菌群為腸道內(nèi)常在菌，故本文未對細(xì)菌(主要是大腸桿菌和沙門菌)進(jìn)行檢測鑒定；寄生蟲性病原有線蟲、鉤蟲、蛔蟲、絳蟲、球蟲、隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲等；病毒性病原主要有犬瘟熱、犬細(xì)小病毒病、犬傳染性肝炎、犬冠狀病毒和犬輪狀病毒感染等。此寵物園犬只均進(jìn)行了疫苗接種和藥物驅(qū)蟲。

本研究通過對腹瀉性疾病的犬糞便樣品進(jìn)行PCR分子鑒定，確診引起犬腹瀉的主要病原，針對性地對病毒性和寄生蟲性病原，合理采用對癥治療、對因治療和輔助支持治療方法進(jìn)行全面有效的救治預(yù)防，以期為臨床上有效防治犬腹瀉提供科學(xué)參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品 按照采樣要求，對有多次腹瀉癥狀的犬，觀察其糞便狀態(tài)、顏色及無明顯膿血等癥狀的樣品進(jìn)行采集，無菌收集新鮮糞便1 g左右，放于保存液中冰盒及時運至實驗室進(jìn)行分析。

1.2 主要試劑與儀器 PremixExTaq和DNA Marker DL-2 000均購自寶生物工程(大連)有限公司；糞便基因組DNA提取試劑盒自購自天根生化科技(北京)有限公司；病毒RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自凱杰(Qiagen)生物技術(shù)有限公司；PCR引物合成及PCR產(chǎn)物測序均由蘇州金唯智生物科技有限公司完成，其他均為國產(chǎn)常規(guī)試劑。主要儀器包括PCR儀、電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)等。

1.3 基因組DNA和病毒RNA的提取 利用天根生化科技(北京)有限公司糞樣DNA提取試劑盒對糞樣進(jìn)行基因組DNA的提取，利用Qiagen病毒RNA提取試劑盒提取糞樣中的病毒RNA，具體的操作步驟均參考試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 PCR分子鑒定分析 參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的病毒總RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，依次為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR引物序列及其相關(guān)信息詳見表1；PCR擴(kuò)增酶為寶生物工程(大連)有限公司的PremixTaq酶，擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：PremixTaq25.0 μL，上下游引物(濃度10 μmol/L)各2 μL，模板DNA3 μL，補(bǔ)充水18 μL 至PCR反應(yīng)體系為50 μL。擴(kuò)增后PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳(電壓120 V， 時間30 min)，電泳完成后在凝膠成像儀中觀察結(jié)果并拍照。測序結(jié)果經(jīng)峰圖分析后，在GenBank上用采用BLAST方法進(jìn)行同源序列搜索，應(yīng)用MEGA 5.0軟件和Clustal Omega在線軟件進(jìn)行核苷酸序列和氨基酸序列同源性的分析。

表1 犬腹瀉相關(guān)病原的PCR分子鑒定所用引物

2 結(jié)果與分析

基于隱孢子蟲18S rRNA 基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增出約587 bp的目的片段(如圖1A)，4(4/18)例隱孢子蟲陽性均為犬隱孢子蟲(Cryptosporidiumcanis)。基于賈第鞭毛蟲β-giardin 基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增出約511 bp的目的片段(如圖1B)，6(6/18)例賈第鞭毛蟲陽性的基因型包括Giardiaintestinalisassemblage B(n=1)、C(n=2)和D(n=3)。基于犬瘟熱病毒CDV-H基因，未擴(kuò)增到目的片段；基于犬細(xì)小病毒CPV-VP基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增出約568 bp的目的片段(如圖1C)，犬細(xì)小病毒陽性為CPV2型(18/18)。

3 結(jié)論與討論

犬腹瀉的致病因素很多且非常復(fù)雜，這個寵物園的18只患犬主要是病原感染引起的腹瀉，包括病毒性感染(100.0%)腹瀉和寄生蟲性感染(44.4%)，可見犬只均為帶毒帶蟲的隱性感染狀態(tài)。本次通過對病犬的糞便進(jìn)行病原性診斷，發(fā)現(xiàn)病毒性腹瀉主要由犬細(xì)小病毒引起，癥狀明顯且死亡率高[5]；寄生蟲性腹瀉常由隱孢子蟲、賈第鞭毛蟲等引起[6]。本次患病犬只均在寵物園飼養(yǎng)管理下生長，疫苗預(yù)防和營養(yǎng)保健管理可視為相同，生活環(huán)境相同，故不考慮環(huán)境應(yīng)激和飼養(yǎng)管理。犬只腹瀉的原因是由多種病原相互作用引起的，大腸桿菌菌群常在腸道存在且處于生態(tài)平衡狀態(tài)；隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲也為條件性致病性原蟲；當(dāng)犬只的免疫力下降，機(jī)體環(huán)境變化而菌群失調(diào)時，腹瀉病就暴發(fā)了，此次誘因是感染了犬細(xì)小病毒。堅持預(yù)防為主、治療為輔的原則，實施“防重于治”的方針，按時按程序進(jìn)行犬只的傳染病疫苗免疫，提高免疫力。準(zhǔn)確鑒別診斷病原尤為重要，這樣才能為采取對因治療、對癥治療和輔助支持療法措施提供科學(xué)依據(jù)。

圖 1 各病原檢測基因PCR擴(kuò)增結(jié)果A:隱孢子蟲18S rRNA 基因 ; B:賈第鞭毛蟲β-giardin基因 ； C:犬細(xì)小病毒VP基因

M: DL-2 000 bp DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； P+：陽性對照；N-：陰性對照； 1-4、5、6：樣品1-4、5、6