潘百明 ， 何彩梅 ， 梁昌祥 ， 韋學豐 ， 周慧玲

(賀州學院食品與生物工程學院 ， 廣西賀州542899)

禽大腸桿菌病是由禽致病性大腸桿菌引起的一種傳染病，該病存在于世界各地的家禽中，引起心包炎、肝周炎、氣囊炎、腹膜炎、輸卵管炎、滑膜炎、大腸桿菌性肉芽腫和臍炎等病變，嚴重時會導致發(fā)病家禽出現(xiàn)敗血癥和死亡；禽致病性大腸桿菌存在多種血清型，對多種抗生素、磺胺類和呋喃類藥物都敏感，但極易產生耐藥性。本文在10個集約化養(yǎng)雞場分離出10個禽致病性大腸桿菌菌株，選用6種較為敏感(近期曾做過試驗)的抗生素做對照，用姜黃揮發(fā)油做藥敏試驗，尋找中藥防治禽大腸桿菌病的方法。

姜黃別名毛姜黃、郁金，為姜科多年生草本植物；姜黃最主要的兩個活性成分為姜黃素及姜黃揮發(fā)油，是一種可以藥食兩用的植物香料[1]，據國內外的相關研究報告，姜黃揮發(fā)油對致病性菌均有一定的抑菌活性[2]，對大腸桿菌等具有抗菌活性，對金黃色葡萄球菌等作用較為明顯[3]。本試驗采用超聲波輔助提取法提取姜黃揮發(fā)油，對病禽分離出來的致病性大腸桿菌進行藥敏試驗，為有效防治禽大腸桿菌病提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 姜黃片 購自賀州學院東區(qū)后門旁的瑞康藥店，產地為廣西，由安徽人民中藥飲片有限公司生產。

1.1.2 試驗菌 由賀州學院微生物學實驗室分別從10個不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)集約化養(yǎng)雞場病雞分離，根據病理變化、鏡檢、細菌培養(yǎng)特性和生理生化試驗，鑒定為致病性大腸桿菌。

1.1.3 藥敏試紙 杭州天和微生物試劑有限公司的藥敏紙片。

1.1.4 主要儀器 超聲波儀(JY98-3D)：寧波新藝生物科技股份有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋(YXQ-LS-100SⅡ)：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；循環(huán)水式多用真空泵(SHZ—DⅢ)：河南省予華儀器有限公司；電子分析天平(FA2004)：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；電熱培養(yǎng)箱恒溫(DHP-9082)：上海齊欣科學儀器有限公司；雙人雙面凈化工作臺(SW-CJ-2F)：蘇州凈化設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 姜黃揮發(fā)油的提取 參照宋曰欽[4]等的提取方法提取姜黃揮發(fā)油，將姜黃片于粉碎機粉碎后，分別稱取3份30 g的姜黃粉末過30目的標準篩后置于洗凈干燥的三角瓶中，按1∶10的比例分別量取300 mL的石油醚于瓶里，分別放在超聲波清洗器里，設置溫度為20 ℃～30 ℃，功率為100 w，時間為30 min；經過超聲波處理后，抽濾，將濾液放在圓底燒瓶中，使用旋轉蒸發(fā)儀來濃縮濾液，溫度控制在60 ℃，直至冷凝管無液體滴落，產品在蒸餾瓶里，收集瓶里回收石油醚；將蒸餾瓶倒置在洗凈干燥后的小燒杯里，里面的油會緩慢流下來，靜置30 min，將3次所收集的揮發(fā)油混合放一起得到橙黃色的油狀的液體，避光保存?zhèn)溆?。經測定姜黃揮發(fā)油的含量為7%。

1.2.2 姜黃揮發(fā)油的配制 將以上的揮發(fā)油用1%吐溫-80水溶液溶解并配制姜黃揮發(fā)油溶液的濃度為200 mg/mL、100 mg/mL、50 mg/mL、25 mg/mL、12.5 mg/mL、6.25 mg/mL的溶液。

1.2.3 藥敏試驗

1.2.3.1 姜黃揮發(fā)油抑菌濃度的選擇 取自病雞分離出來的大腸桿菌菌株，在無菌操作下于營養(yǎng)瓊脂平板以劃線方式將細菌均勻涂布到整個平板上；將牛津杯輕輕地放在平板上，將姜黃揮發(fā)油溶液慢慢倒入牛津杯，不可溢出，每個平板上放3個牛津杯，將各個濃度梯度做好標記，放置于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃，培養(yǎng)24 h。

1.2.3.2 姜黃揮發(fā)油對10個菌株的藥敏試驗 選用平時做過藥敏試驗較為敏感的環(huán)丙沙星、慶大霉素、丁胺卡那霉素、氟本尼考、多西環(huán)素、頭孢噻肟等6種抗生素和姜黃揮發(fā)油對10個不同大腸桿菌菌株做藥敏試驗，6種抗生素按藥敏紙片法做藥敏試驗，培養(yǎng)基為普通營養(yǎng)瓊脂；姜黃揮發(fā)油采用牛津杯法做藥敏試驗，選擇(1.2.3.1試驗)最佳濃度為25 mg/mL的姜黃藥物濃度，判斷標準見表1。

表1 藥敏實驗判定標準

2 結果與分析

2.1 姜黃揮發(fā)油抑菌濃度 見表2。

表2 姜黃揮發(fā)油在不同的濃度下的抑菌情況

由表2可知，25 mg/mL姜黃揮發(fā)油濃度抑菌效果已達到高敏，大于此濃度的50 mg/mL、100 mg/mL和200 mg/mL 3個濃度均為高敏，因此在使用姜黃揮發(fā)油防治大腸桿菌病時并不是濃度越高越好，本試驗只設定200 mg/mL、100 mg/mL、50 mg/mL、25 mg/mL、12.5 mg/mL、6.25 mg/mL 6個姜黃揮發(fā)油濃度，試驗結果25 mg/mL濃度為最低抑菌(高敏)濃度，超過該濃度反而造成藥物浪費；小于該濃度的對大腸桿菌病達不到治療效果。

2.2 姜黃揮發(fā)油(25 mg/ /mL)對10株大腸桿菌的藥敏結果 見表3。

表3 姜黃揮發(fā)油及6種抗生素對10株大腸桿菌的藥敏結果

從表3可以看到，10株大腸桿菌對姜黃揮發(fā)油均敏感，其中9株達到高敏；而6種抗生素有3種存在不同程度的耐藥性，這3種抗生素口服用藥比較方便，市場比較普遍，這可能在場內常用導致；較敏感的3種抗生素中，敏感性也存在差異，其中頭孢噻肟有產生耐藥的趨勢，如果長期使用會產生耐藥性。

3 討論

本試驗結果表明，姜黃揮發(fā)油對致病性禽大腸桿菌具有高度的敏感性，可以用于預防和治療禽大腸桿菌??；姜黃揮發(fā)油濃度為25 mg/mL，抑菌圈最大，抑菌作用較好，具有抑殺禽大腸桿菌的作用；可長期用作大腸桿菌病的治療藥物和預防保健藥物；由于大腸桿菌存在多種血清型，極易產生耐藥性，開發(fā)姜黃藥劑對于預防和治療禽大腸桿菌病有很重要的意義；集約化養(yǎng)雞場可以嘗試姜黃與抗生素配合使用，減少耐藥性的產生，也可以用姜黃粉碎拌入飼料進行預防，減少和預防禽大腸桿菌病的發(fā)生。