高日明 ， 范秀麗 ， 李玉安 ， 李甜甜 ， 范 娟 ， 關(guān)平原 ， 楊漢春

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 北京海淀100193 ； 2.金宇保靈生物藥品有限公司 ， 內(nèi)蒙古呼和浩特010030 ； 3.揚(yáng)州優(yōu)邦生物藥品有限公司 ， 江蘇揚(yáng)州225008 ；4.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 ， 內(nèi)蒙古呼和浩特010018)

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，H.parasuis)主要引發(fā)豬的多發(fā)性漿膜炎、腦膜炎和關(guān)節(jié)炎。H.parasuis是最常見的繼發(fā)性感染菌之一，臨床上常繼發(fā)于PRRS和PMWS[1]，主要引起4～12周齡仔豬發(fā)病，且抗生素對(duì)其治療效果不顯著，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。截至目前，H.parasuis已有15個(gè)血清型被確定，但仍有部分菌株尚未確定血清分型。許多臨床分離株已經(jīng)鑒定，且血清型4、5、12、13型和14型被認(rèn)為是我國(guó)當(dāng)前流行的主要H.parasuis[2-3]。

臨床上抗生素的廣泛使用造成了耐藥性的H.parasuis不斷產(chǎn)生，給該疾病的控制帶來了巨大的挑戰(zhàn)。疫苗免疫仍被認(rèn)為是當(dāng)前防控格拉澤病重要手段且能預(yù)防耐藥性的產(chǎn)生[4]。有報(bào)道表明，含有重組轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白B(TbpB)、富含TbpB的外膜蛋白及OMP2或D15及來自O(shè)MP的PalA和HPS-06257的亞單位疫苗對(duì)HPS攻毒只能提供部分保護(hù)[4-6]。當(dāng)前，H.parasuis血清1型、4型、5型及血清6型的部分菌株分別作為商業(yè)滅活疫苗已在中國(guó)、美國(guó)和西班牙廣泛使用，在該病的預(yù)防上發(fā)揮著重要的作用[7]。

本研究于2009年至2016年期間分別采集華東地區(qū)45個(gè)發(fā)病豬場(chǎng)發(fā)病豬或?yàn)l死豬病料進(jìn)行細(xì)菌分離。首先對(duì)分離株的16S rRNA基因進(jìn)行PCR初步鑒定，隨后對(duì)鑒定的陽性分離株進(jìn)行血清型鑒定，根據(jù)優(yōu)勢(shì)流行不同血清型各菌株制備了副豬嗜血桿菌病三價(jià)滅活疫苗，并對(duì)該疫苗的免疫效力進(jìn)行了評(píng)估，攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明，該疫苗可有效抵抗對(duì)應(yīng)血清型強(qiáng)毒株的攻擊，為多價(jià)副豬嗜血桿菌的疫苗研制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病料來源 揚(yáng)州優(yōu)邦生物藥品有限公司2009年至2016年分別從華東地區(qū)45個(gè)豬場(chǎng)發(fā)病豬只139頭發(fā)病豬采集453份病料(包括心臟、肝臟、脾臟、肺臟、心包積液、胸腔積液、關(guān)節(jié)積液)。

1.2 試劑背景 TSB培養(yǎng)基，購(gòu)自美國(guó)BD (Becton, Dickinson and Company)公司；Rehydragel系列鋁膠佐劑，購(gòu)自美國(guó)通用化學(xué)(General Chemical)公司；新生牛血清，購(gòu)自杭州四季青生物有限公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；無菌脫纖綿羊血，購(gòu)自南京便診生物科技有限公司；生化微量鑒定管，購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。H.parasuis4型、5型和12型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)饋贈(zèng)，標(biāo)準(zhǔn)陰性血清為HSP抗原、抗體檢測(cè)均為陰性健康仔豬血清。副豬嗜血桿菌凝集抗原制備方法參照王建學(xué)位論文[8]。

1.3 方法

1.3.1 副豬嗜血桿菌分離、培養(yǎng)與純化 從采集的豬病料(心臟、肝臟、脾臟、肺臟、心包積液、胸腔積液、關(guān)節(jié)積液)中無菌取樣并接種TSA，置于37 ℃、5% CO2中培養(yǎng)24～48 h，觀察結(jié)果。挑取圓形、光滑、濕潤(rùn)和無色透明的可疑菌落，再次接種TSA、巧克力瓊脂平板、兔鮮血瓊脂平板及普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，反復(fù)進(jìn)行2～3次純化，直到無雜菌為止。

1.3.2 分離株染色和鏡檢 挑取TSA瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)細(xì)小、透明、露珠狀疑似菌落涂片，革蘭染色鏡檢，顯微鏡下觀察細(xì)菌的形態(tài)特征。

1.3.3 生化鑒定 挑取已純化單菌落分別接種相應(yīng)的生化鑒定管(含2 μg/mL NAD)，于37 ℃、5% CO2中培養(yǎng)48 h后，觀察結(jié)果。

1.3.4 血清分型 將經(jīng)鑒定為H.parasuis的菌株送至揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部禽用生物制劑創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室利用玻板凝集法進(jìn)行血清學(xué)分型[9]。

1.3.5 分離菌株Omp P5 基因擴(kuò)增與鑒定

1.3.5.1 引物設(shè)計(jì) 參照Oliveira 等[10]的報(bào)道合成引物。16S rRNA基因引物序列為上游引物P1為5′-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3′，下游引物P2為5′-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為821 bp，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3.5.2 PCR鑒定 取分離株培養(yǎng)菌液離心收集菌體加PBS重懸后沸水浴10 min，12 000 r/min離心，取上清獲得分離株基因組。PCR 反應(yīng)體系(25 μL)：MixTaq12.5 μL，上游引物P1(10 pmol/μL) 0.5 μL，下游引物P2(10 pmol/μL) 0.5 μL，基因組模板2 μL。進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳并觀察結(jié)果。

1.3.5.3 副豬嗜血桿菌分離株對(duì)BALB/c小鼠的致病性試驗(yàn) 將240只BALB/c小鼠隨機(jī)分成24組，每組10只，設(shè)置23組為H.parasuis攻毒組，1組為PBS對(duì)照組。4～1至4～6共6組均攻擊4型菌株(2.5×109CFU/只)，5～1至5～9共9組均攻擊5型菌株(2.5×109CFU/只)，12～1至12～8共8組均攻擊12型菌株(2.5×109CFU/只)，對(duì)照組腹腔注射等量PBS，攻毒后14 d觀察小鼠死亡情況。

1.3.6 副豬嗜血桿菌三價(jià)滅活疫苗的制備 取分離株中篩選出的4型SH株、5型GD株和12型JS株劃線接種于TSA平板，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，挑取單個(gè)菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，使3種血清型的細(xì)菌濃度達(dá)2.5×1010CFU/mL，等體積混合，加入終濃度為0.2%甲醛，于37 ℃、100 r/min滅活24 h，與鋁膠佐劑1∶5混合，制成鋁膠滅活疫苗。

1.3.7 疫苗免疫效力評(píng)估

1.3.7.1 副豬嗜血桿菌病三價(jià)滅活疫苗免疫豬血清抗體檢測(cè) 將20頭14日齡的健康仔豬設(shè)置為免疫組(免疫/攻毒組)，并設(shè)置15頭陰性對(duì)照組。免疫組頸部肌肉注射2.0 mL副豬嗜血桿菌3價(jià)滅活疫苗，首免21 d后以相同劑量加強(qiáng)免疫1次，對(duì)照組以相同免疫程序注射2.0 mL PBS。首免后分別在1、2、3、4周和5周時(shí)采血并分離血清，利用微量凝集法測(cè)定針對(duì)3種不同血清型副豬嗜血桿菌抗體效價(jià)觀察凝集現(xiàn)象并判定結(jié)果。

1.3.7.2 疫苗免疫仔豬的攻毒試驗(yàn) 二免2周后對(duì)所有免疫組和未免疫組進(jìn)行腹腔注射攻毒，免疫組按照5頭/組隨機(jī)分為四組，其中三組分別腹腔注射4型SH株(2×1010CFU/頭)、5型GD株(5×109CFU/頭)和12型JS株(5×109CFU/頭)，剩下一組為免疫/不攻毒組，腹腔注射等體積的PBS，未免疫/攻毒對(duì)照組隨機(jī)分為三組(每組5頭)，攻毒后，每日測(cè)量體溫，并觀察感染豬的臨床表現(xiàn)及死亡情況，連續(xù)觀察14 d，對(duì)死亡豬進(jìn)行剖檢并觀察病理變化。

2 結(jié)果

2.1 分離菌株的形態(tài)與培養(yǎng)特性 34株分離株在TSA平板上均呈光滑圓潤(rùn)、無色或灰白色的小型菌落，革蘭染色后鏡檢顯示為革蘭陰性小球桿菌。

34株分離株在含NAD和血清的TSA平板上能正常生長(zhǎng)，在含NAD和綿羊鮮血TSA瓊脂平板上生長(zhǎng)狀態(tài)最好，而在S、S、麥康凱和不含NAD的TSA瓊脂平板上皆不生長(zhǎng)。

2.2 分離菌株對(duì)BALB/c小鼠的致病性 如表1所示，相同攻毒劑量的不同血清型菌株可導(dǎo)致小鼠不同的致死率，且同一血清型的不同分離株致死率也不盡相同。具體如下，血清4型菌株致病力不同，SH1012株毒力最強(qiáng)，死亡率為5/10；血清5型菌株致病力皆比較強(qiáng)，致死率皆在5/10以上，其中GD1022株毒力最強(qiáng)，死亡率可達(dá)9/10；血清12型菌株致病力均較強(qiáng)，小鼠死亡率大于4/10，其中JS1015株毒力最強(qiáng)，可導(dǎo)致7/10小鼠死亡。

表1 不同血清型副豬嗜血桿菌分離株對(duì)BALB/c小鼠的致病性

2.3 生化鑒定 對(duì)27株已確定血清型的H.parasuis分離株進(jìn)行生化鑒定，將細(xì)菌純培養(yǎng)物接種于生化微量鑒定管中，37 ℃培養(yǎng)，生化鑒定結(jié)果表明，分離株均能發(fā)酵葡萄糖、乳糖、半乳糖、蔗糖、果糖和木糖，對(duì)尿酶、硫化氫、硝酸鹽和吲哚試驗(yàn)反應(yīng)均呈陰性，均具有NAD依賴性，結(jié)果與H.parasuis的生化特性相符。

2.4 血清分型 將34株分離株進(jìn)行血清分型，其中6株血清4型(17.65%)、9株血清5型(29.41%)、8株血清12型(29.41%)、4株血清13型(11.76%)以及7株未定型菌株(表2)，結(jié)果表明，我國(guó)目前流行的HPS以4型、5型及12型血清型為主。

表2 34株分離株信息

2.5 PCR鑒定 以分離株的DNA作為模板,以16S rRNA為特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳結(jié)果顯示，從所分離的34株副豬嗜血桿菌均能擴(kuò)增得到約821 bp大小的特異性條帶，與預(yù)期一致。

2.6 疫苗免疫仔豬血清抗體檢測(cè) 取14日齡的健康仔豬15頭為免疫組，并設(shè)置15頭陰性對(duì)照組。免疫組頸部肌肉注射2.0 mL上述副豬嗜血桿菌三價(jià)滅活疫苗，首免21 d后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，免疫劑量和免疫方式與首免相同，對(duì)照組以相同的免疫方式注射2.0 mL PBS。分別在首次免疫后1、2、3、4、5周時(shí)對(duì)其采血并分離血清，利用微量凝集法測(cè)定針對(duì)3種血清型副豬嗜血桿菌抗體效價(jià)，計(jì)算每組的平均效價(jià)，結(jié)果如圖1所示，副豬嗜血桿菌3價(jià)滅活疫苗免疫后1周并未檢測(cè)到針對(duì)4型、5型及12型副豬嗜血桿菌抗體效價(jià)。從免疫后第2周開始，抗體效價(jià)逐漸增長(zhǎng)，其中針對(duì)4型和12型副豬嗜血桿菌抗體效價(jià)分別于對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.001；P<0.01)。自首免后第3周開始，針對(duì)3種血清型副豬嗜血桿菌抗體效價(jià)顯著提高，均與對(duì)照組差異極顯著(P<0.001)。

圖1 仔豬首免后5周血清中各血清型的微量凝集價(jià)

2.7 疫苗免疫仔豬對(duì)攻毒的保護(hù)效果 疫苗免疫保護(hù)力結(jié)果表明(如表3所示)3價(jià)副豬嗜血桿菌滅活疫苗對(duì)SH株和JS株可以提供5/5免疫保護(hù)，對(duì)GD株可以提供4/5免疫保護(hù)，而不免疫/攻毒組針對(duì)3個(gè)H.parasuis分離株分別出現(xiàn)了4頭、5頭和4頭豬只死亡，死亡率分別為4/5、5/5和4/5，免疫/不攻毒組的豬則全部存活。綜上，3價(jià)滅活疫苗可有效提供針對(duì)3株不同血清型毒株免疫保護(hù)力。

表3 3價(jià)副豬嗜血桿菌滅活疫苗免疫效力試驗(yàn)

2.8 仔豬攻毒后臨床癥狀和病理變化 攻毒后80%仔豬呈現(xiàn)明顯的臨床癥狀，主要表現(xiàn)為體溫升至40.5 ℃以上，咳嗽，呼吸困難，關(guān)節(jié)腫脹，消瘦，跛行。剖檢病理變化主要表現(xiàn)為腹腔積液、胸腔纖維液滲出、心包積液、心包積厚和粘連、腹腔纖維滲出和粘連及關(guān)節(jié)腔炎性滲出，而未攻毒對(duì)照組無異常臨床表現(xiàn)。

3 討論

本試驗(yàn)共分離34株H.parasuis，其中，6株血清4型(17.65%)、10株血清5型(29.41%)、10株血清12型(29.41%)、4株血清13型(11.76%)，表明血清4型、5型和12型副豬嗜血桿菌是我國(guó)流行的血清型，與之前報(bào)道的結(jié)果相符[11-13]。

以H.parasuis為病原的格拉澤病引發(fā)豬的高發(fā)病率和高死亡率，給我國(guó)生豬養(yǎng)殖帶來了重大的經(jīng)濟(jì)損失。當(dāng)前，有效的商業(yè)疫苗還不能對(duì)所有血清型的H.parasuis帶來交叉保護(hù)[13-14]。有報(bào)道表明，血清4型和5型副豬嗜血桿菌滅活疫苗可以減少由4型、5型、13型和14型H.parasuis感染所引起的死亡率和臨床癥狀，但其并不能保護(hù)我國(guó)主要流行的12型HPS感染[7]。因此，制備能夠保護(hù)4型、5型和12型H.parasuis感染的3價(jià)滅活疫苗十分必要。

本研究以篩選出的4型SH1012株、5型GD1022株和12型JS1015株作為制備副豬嗜血桿菌病三價(jià)滅活疫苗的候選菌株，并進(jìn)行仔豬攻毒保護(hù)試驗(yàn)，結(jié)果顯示，仔豬二免3價(jià)疫苗后顯著提高針對(duì)H.parasuis4型、5型、12型的血清效價(jià)，且顯著降低各血清型H.parasuis強(qiáng)毒攻毒時(shí)發(fā)病率和死亡率。表明該3價(jià)副豬嗜血桿菌滅活疫苗具有較好的免疫原性，可以抵抗對(duì)應(yīng)血清型H.parasuis強(qiáng)毒的攻擊，具有較好臨床推廣前景。