朱飛 徐秦嵐 郭安臣 王群

癲癇是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)慢性疾病，患病率為4‰～7‰，目前全球約有5 000萬癲癇患者，我國癲癇患者人數(shù)約900萬。臨床上大約有70%的癲癇患者可以通過藥物控制發(fā)作，但是仍有約30%的患者為藥物難治性癲癇。對于難治性癲癇患者來說，盡管經(jīng)過長期抗癲癇藥物治療仍然發(fā)作頻繁，長期癲癇發(fā)作會嚴(yán)重影響患者的日常生活和學(xué)習(xí)、工作能力，損害患者的認(rèn)知功能，導(dǎo)致患者出現(xiàn)嚴(yán)重的精神、心理障礙[1]。難治性癲癇的控制已經(jīng)成為一項重要的公共衛(wèi)生問題，基于新靶點(diǎn)的抗癲癇藥物研發(fā)有重要的臨床意義。

生酮飲食是一種高脂肪、低碳水化合物飲食，其治療難治性癲癇療效確切[2-3]，然而作用機(jī)制尚不十分明確。長期生酮飲食患者不易耐受，并引發(fā)諸多不良反應(yīng)，例如兒童生長發(fā)育延遲、成人動脈粥樣硬化風(fēng)險增加等[3-4]，所以明確生酮飲食的作用機(jī)制，并應(yīng)用于新藥研發(fā)有重要意義。生酮飲食中多余的脂肪被分解代謝為酮體，包括乙酰乙酸、β羥丁酸和丙酮，目前有研究認(rèn)為給動物急性注射酮體可以抑制癲癇發(fā)作[5-7]，然而具體機(jī)制尚不明確。因?yàn)橥w是一種酸性物質(zhì)，而酸敏感通道是一種酸性條件下激活的H+門控通道，據(jù)此推測酮體和酸敏感通道之間可能存在一定相關(guān)性。所以，本研究針對難治性癲癇的治療新方法進(jìn)行研究設(shè)想，利用膜片鉗技術(shù)探討三種酮體對于海馬神經(jīng)元表面酸敏感通道電流的影響，為基于“酮體—酸敏感通道”的抗癲癇新藥靶點(diǎn)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取出生24 h內(nèi)的Wistar乳鼠(由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供)，原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元。

1.2 主要試劑及儀器設(shè)備

1.2.1 主要試劑 乙酰乙酸鋰、β羥丁酸、丙酮、多聚賴氨酸、左旋谷氨酰、胰酶、谷氨酸、葡萄糖(以上試劑購自sigma)，B27補(bǔ)充劑、胎牛血清、DMEM、神經(jīng)元培養(yǎng)基(以上試劑購自gibco)，青霉素/鏈霉素(Hyclone)，HEPES(santa cruz)，PBS(TaKaRa)。

1.2.2 主要儀器設(shè)備 EPC10膜片鉗放大器Heka(Germany)，數(shù)據(jù)獲取軟件Heka(Germany)，微電極拉制儀(P97，Sutter Instruments)，分析軟件Molecular Device(USA)，二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱Esco(Singapore)，倒置顯微鏡Motic(IX71，Olympus)，微操縱器(MP285，Sutter Instruments)，毛細(xì)玻璃管(BF150-86-10，Sutter Instruments)，移液器Eppendorf(Germany)。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元 新生鼠迅速斷頭，剝離大腦放入冰的PBS中，等待2 min；把腦取出放入一倒有冰PBS的平皿中，將海馬取出，放置于10 mL含冰PBS離心管中；將海馬放入冰的PBS中洗1～2次；吸干PBS，加入胰蛋白酶，37 ℃培養(yǎng)箱中20 min，每隔5 min搖晃一下；取出酶消化后的組織，吸去酶液，加入冰的PBS終止反應(yīng)，洗2～3次；靜置2 min，去掉上層液體；加入1 mL的DMEM進(jìn)行吹打，15次后靜置2 min，收集上清液，放入離心管中；再加入1 mL DMEM，繼續(xù)吹打10次，再收集上清液入同一皿中；第3次再加1 mL，重復(fù)操作，3次后未消化的組織棄掉；將收集到的上清液放入預(yù)先鋪好的板中搖勻；4小時后輕搖幾下，把死細(xì)胞和碎片吸走，再用DMEM清洗1次后換neurobasal+b27+L-Glu培養(yǎng)液；第2 d，半數(shù)換液；隔2 d換1次。

1.3.2 膜片鉗技術(shù)檢測酮體對大鼠海馬神經(jīng)元酸敏感通道開放狀態(tài)的影響用微電極拉制儀將毛細(xì)玻璃管拉制成記錄電極，電極填充內(nèi)液，在倒置顯微鏡下操縱微電極操縱儀，將記錄電極接觸到細(xì)胞上，給予負(fù)壓抽吸，形成GΩ封接；形成GΩ封接后進(jìn)行快速電容補(bǔ)償，然后繼續(xù)給予負(fù)壓，吸破細(xì)胞膜，形成全細(xì)胞記錄模式；然后進(jìn)行慢速電容的補(bǔ)償并記錄膜電容及串聯(lián)電阻；電壓鉗模式下-70 mV穩(wěn)定5 min后-80 mV下進(jìn)行酸敏感通道記錄。所得數(shù)據(jù)Clampfit進(jìn)行線下分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

乙酰乙酸、β羥丁酸和丙酮均可以顯著抑制大鼠海馬神經(jīng)元表面酸敏感通道的開放。在pH6.0條件下分別向細(xì)胞外液中加入三種酮體后酸敏感通道的電流波幅均顯著降低，抑制率分別為92、47、77%(圖1～3，表1～3)。

圖1 乙酰乙酸可以顯著抑制大鼠海馬神經(jīng)元表面酸敏感通道的開放

3 討 論

癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)第二大疾病，患病率為4‰～7‰，目前全球約有5 000萬癲癇患者，我國癲癇患者人數(shù)約900萬。癲癇是一種慢性病，給個人、家庭和社會帶來嚴(yán)重的負(fù)面影響，無論在發(fā)達(dá)國家還是在發(fā)展中國家癲癇都已經(jīng)成為一個重要的公共衛(wèi)生問題。目前臨床上大約70%的癲癇患者可以通過藥物控制發(fā)作，但是仍有約30%患者為藥物難治性癲癇。對于藥物難治性癲癇患者來說，盡管經(jīng)過長期正規(guī)抗癲癇藥物治療仍然發(fā)作頻繁。長期癲癇發(fā)作會嚴(yán)重影響患者的日常生活和學(xué)習(xí)、工作能力，損害患者的認(rèn)知功能，并引發(fā)患者出現(xiàn)嚴(yán)重的精神、心理障礙[1]，所以對于難治性癲癇的控制顯得尤為重要?；谛掳悬c(diǎn)的抗癲癇藥物研發(fā)有重要意義，可能帶來巨大的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。

表1 乙酰乙酸對大鼠海馬神經(jīng)元酸敏感通道電流的抑制作用

注：與對照組比較，*P<0.05

圖2 β羥丁酸可以顯著抑制大鼠海馬神經(jīng)元表面酸敏感通道的開放

表2 β羥丁酸對大鼠海馬神經(jīng)元酸敏感通道電流的抑制作用

注：與對照組比較，*P<0.05

圖3 丙酮可以顯著抑制大鼠海馬神經(jīng)元表面酸敏感通道的開放

表3 丙酮對大鼠海馬神經(jīng)元酸敏感通道電流的抑制作用

注：與對照組比較，*P<0.05

難治性癲癇發(fā)作頻繁，迫切需要新的抗癲癇藥物治療靶點(diǎn)。生酮飲食是一種高脂肪、低碳水化合物飲食，治療難治性癲癇效果確切，但機(jī)制尚不明確。長期生酮飲食患者不易耐受，如能明確其作用機(jī)制并應(yīng)用于新藥研發(fā)將有重要意義。在生酮飲食中過多的脂肪被分解代謝為酮體(包括乙酰乙酸、β羥丁酸、丙酮)，有研究表明給動物急性注射酮體可以抑制癲癇發(fā)作，說明生酮飲食可能通過酮體來發(fā)揮作用，但具體機(jī)制尚不明確。因?yàn)橥w是一種酸性物質(zhì)，而酸敏感通道是酸性條件下開放的通道，所以本研究設(shè)想酮體可能通過調(diào)節(jié)酸敏感通道來發(fā)揮作用。

生酮飲食是一種高脂肪、低碳水化合物飲食，對于難治性癲癇的療效確切[8]，但具體機(jī)制尚不明確。長期生酮飲食患者不易耐受，并引發(fā)諸多不良反應(yīng)，如嚴(yán)重胃腸道反應(yīng)、兒童厭食癥、營養(yǎng)元素缺乏、生長發(fā)育遲滯以及成人動脈粥樣硬化風(fēng)險增加等[3-4]。所以，明確生酮飲食的抗癲癇作用機(jī)制，應(yīng)用于新藥研發(fā)，保留其主要抗癲癇效果，同時避免長期高脂飲食的痛苦，將有重要的臨床意義。

在生酮飲食中多余的脂肪酸在肝內(nèi)進(jìn)行β-氧化產(chǎn)生乙酰輔酶A，之后被分解代謝為酮體，包括乙酰乙酸、β-羥丁酸和丙酮。有研究認(rèn)為生酮飲食的抗癲癇作用與酮體有關(guān)，急性給予酮體在多種動物癲癇模型中均能夠有效控制癲癇發(fā)作[5-6]，但是具體機(jī)制尚不十分明確，有研究認(rèn)為酮體可能通過作用于K+ATP通道、NMDA或GABA通道來發(fā)揮作用[9,10]。

因?yàn)橥w是一種酸性物質(zhì)，而酸敏感通道是一種酸性條件下激活的H+門控通道，所以本研究推測酮體與酸敏感通道可能有一定相關(guān)性，因此利用膜片鉗技術(shù)檢測酮體對海馬神經(jīng)元表面酸敏感通道電流的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種酮體均可以顯著抑制海馬神經(jīng)元酸敏感通道的開放，抑制率分別為92、47和77%。據(jù)此本研究推測生酮飲食可能是通過其代謝產(chǎn)物酮體抑制酸敏感通道從而發(fā)揮抗癲癇作用。

目前已知酸敏感通道(ASICs，Acid-sensing ion channels)，也稱作H+門控離子通道，是一類被質(zhì)子激活的陽離子通道，屬于退化素/上皮鈉離子通道(degenerin/epithelial Na+ channels,DEG/ENaC)家族，因?yàn)镠+是ASICs通道激動劑，所以ASICs又可以被看成配體調(diào)控的通道家族。ASIC家族成員包括4種基因(Asic1,Asic2,Asic3,Asic4)，到目前為止，已經(jīng)克隆出ASICs的6個亞單位ASIC1a、ASIC1b、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3、ASIC4。組織酸化是激活A(yù)SICs的必要條件，ASICs的激活有賴于pH值快速(<1 s)且顯著的下降[11-13]。

目前ASICs被視為是酸毒性損傷的重要治療靶點(diǎn)，并得到了廣泛的研究[14-15]。Xiong等[16]的研究顯示，腦缺血中腦細(xì)胞無氧代謝增強(qiáng)，pH嚴(yán)重下降，導(dǎo)致嚴(yán)重酸中毒而致ASIC1a激活，鈣離子大量內(nèi)流，細(xì)胞鈣超載后大量死亡。應(yīng)用特異性ASIC1a受體阻斷劑PcTX或非特異性的ASICs受體阻斷劑阿米洛利后發(fā)現(xiàn)，不論是體內(nèi)還是體外實(shí)驗(yàn)酸中毒所致的神經(jīng)元損傷都有顯著的減輕，腦梗死的范圍也大大下降，提示ASIC1a介導(dǎo)了腦缺血過程中酸中毒所致的神經(jīng)元死亡。因?yàn)榘d癇發(fā)作，尤其是癲癇持續(xù)狀態(tài)也是一種嚴(yán)重的傷害性刺激，所以本研究推測嚴(yán)重癲癇發(fā)作后也可能會產(chǎn)生酸敏感通道介導(dǎo)的腦組織酸毒性。又因?yàn)橥w可以抑制酸敏感通道開放，所以推測酮體可以通過抑制酸敏感通道介導(dǎo)的腦組織酸毒性，起到一定的神經(jīng)保護(hù)作用。這一假說有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

目前有關(guān)酸敏感通道和癲癇關(guān)系的研究主要集中在癲癇發(fā)作后體內(nèi)某些酸敏感通道亞單位的表達(dá)變化以及某些拮抗劑對癲癇發(fā)作的直接作用上。Wu等[17]研究發(fā)現(xiàn)給大鼠腹腔注射ASICs拮抗劑阿米洛利能減少大鼠出現(xiàn)RACINE 4級癲癇的比例。癲癇持續(xù)狀態(tài)后ASIC1a/ASIC2a異聚體在梨狀皮層急性期表達(dá)減少，而在之后的慢性自發(fā)性癲癇期增多。Jingjing Liang等[18]給大鼠腹腔注射ASICs拮抗劑阿米洛利后觀察大鼠EEG，發(fā)現(xiàn)阿米洛利顯著減少大鼠匹羅卡品誘發(fā)的放電頻率，同時發(fā)現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)后ASIC1a和ASIC3表達(dá)增多。O.Ievglevskyi等[19]利用膜片鉗技術(shù)觀察非選擇性ASICs抑制劑5p對海馬腦片放電的影響，發(fā)現(xiàn)抑制ASICs后自發(fā)性抑制性突觸后電位放電頻率增強(qiáng)，抑制ASICs能夠減弱無鎂模型和KA模型誘發(fā)的癲癇樣放電。綜上所述，非選擇性ASICs受體拮抗劑可以抑制癲癇發(fā)作。因?yàn)楸狙芯堪l(fā)現(xiàn)酮體可以抑制酸敏感通道，據(jù)此推測酮體可以通過抑制酸敏感通道來減弱神經(jīng)元興奮性，發(fā)揮抗癲癇作用。

綜上所述，酸敏感通道某些拮抗劑可以抑制癲癇發(fā)作，并且酸敏感通道介導(dǎo)了機(jī)體酸毒性作用，而酮體可以抑制酸敏感通道，所以本研究推測酮體可能通過兩條途徑來發(fā)揮抗癲癇作用，一方面可以直接抑制酸敏感通道來減弱神經(jīng)興奮性；另一方面可以抑制酸敏感通道介導(dǎo)的酸毒性作用，在癲癇發(fā)作過程中起到神經(jīng)保護(hù)作用?！巴w—酸敏感通道”有望成為難治性癲癇藥物治療新靶點(diǎn)，基于“酮體—酸敏感通道”的抗癲癇機(jī)制研究有重要的臨床意義。