夏玙，謝軍，黃丹，羅惠波，2，*，楊文斌

（1.四川理工學院生物工程學院，四川自貢643000；2.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室，四川自貢643000；3.四川省食品藥品檢驗檢測院，四川成都611700）

被稱為“酒之骨”的曲，其創(chuàng)新和發(fā)展一直處于重要地位[1]。麩曲制作屬熟料制曲范疇[2]。麩曲制作在于新菌種開發(fā)應(yīng)用，保持功能菌性狀穩(wěn)定，制作技術(shù)創(chuàng)新等方向上努力改進[3]。酵母麩曲以麩皮為原料，蒸熟后接入純種酵母，人工培養(yǎng)的酶制劑[4]。現(xiàn)階段，多數(shù)采用將霉菌、酵母應(yīng)用到麩曲中，用大曲與麩曲混合、小曲與麩曲混合的方法來提高白酒的品質(zhì)[5]。目前，鮮有純種酵母麩曲的相關(guān)報道。

早年，對麩曲原料研究較多。趙希玉等[6]以麩皮為培養(yǎng)基，加少量玉米面，并添加少量鮮酒糟調(diào)節(jié)酸度，對生香酵母的培養(yǎng)溫度控制在34℃～37℃之間，培養(yǎng)時間48 h。麩曲制作常用熟料，為了節(jié)省一部分成本，尹召軍等[7]采用生料、熟料混合配制根霉麩曲，生熟料之比（質(zhì)量比）為4∶6，麩曲接種量為0.8%，水分含量為50%。對不同菌種的麩曲制作也是研究的一大方向。武順等[8]采用響應(yīng)面法對產(chǎn)吡嗪細菌的麩曲制作工藝進行了優(yōu)化研究。郭凱凱等[9]將高產(chǎn)酯釀酒活性干酵母用于清香麩曲酒中，提高了乙酸乙酯和總酯的含量，酒質(zhì)得到提升。姜鵬[10]將酵母菌S1并制成麩曲，按所需小麥總重量的0.5%、1%添加到粉碎后原料中，制成高酯強化大曲，其白酒出酒率、優(yōu)質(zhì)品率、原酒總酸和總酯量均得到有效提高。本試驗以酵母w2在麩曲中的活菌總數(shù)為檢測指標，優(yōu)化酵母麩曲制作中原料配比和培養(yǎng)條件的工藝，并初步應(yīng)用于小曲清香酒。

1 材料與方法

1.1 材料

酵母w2：異常威克漢遜酵母（wickerhamomyces anomalus），濃香型大曲篩選分離所得；YPD培養(yǎng)基：酵母膏 5 g，蛋白胨 10 g，葡萄糖 10 g，瓊脂 10 g；孟加拉紅培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，磷酸二氫鉀1 g，氯霉素0.1 g，硫酸鎂0.5 g，葡萄糖10 g，孟加拉紅0.032 g，瓊脂18.5 g；9%生理鹽水；麩皮、鮮酒糟、玉米粉：市售。

1.2 儀器及設(shè)備

LS-I201微生物培養(yǎng)箱：飛世爾實驗器材（上海）有限公司；EWYR-D2403恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；HT300A自動固相微萃取儀：意大利HTA公司；Agligent 7890A-5975B型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）：美國安捷倫公司；50/30 μm DVB/CAR on PDMS萃取頭：上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母麩曲原料配比用量確定方法

試驗酵母麩曲原料主要為麩皮、玉米粉、鮮酒糟。為研究酵母w2在酵母麩曲不同原料配比下的生長情況，三角瓶小試以各單因素梯度變化，從而確定出酵母w2的麩曲原料配比。

1.3.1.1 麩皮用量確定

配制麩皮用量梯度的酵母麩曲：現(xiàn)稱量麩皮分別為 4、6、8、10、12、14、16 g，玉米粉均為 2 g，鮮酒糟均為4 g于250 mL三角瓶中，水分20%。121℃條件下，滅菌30 min。采用10%的接種量，將酵母w2種子液接種到不同麩皮量的三角瓶中，用玻璃棒充分攪拌均勻，4層紗布封蓋，給予足夠的通氧量。置25℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h。

1.3.1.2 鮮酒糟用量確定

稱量鮮酒糟分別為 1、2、3、4、5、6、7、8 g，麩皮均為10 g，玉米粉均為2 g于250 mL三角瓶中，水分20%。無菌操作，按10%的接種量。培養(yǎng)方式同1.3.1.1。

1.3.1.3 玉米粉用量確定

稱量玉米粉分別為 0、1、2、3、4、5、6、7 g，麩皮均為10 g，鮮酒糟均為4 g于250 mL三角瓶中，水分20%。采用10%的酵母接種量。培養(yǎng)方式同1.3.1.1。

1.3.2 酵母麩曲培養(yǎng)條件的優(yōu)化

應(yīng)用1.3試驗結(jié)果所得到的酵母麩曲的最佳原料配比，研究應(yīng)用此原料配比的酵母麩曲，在不同水分含量、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度下酵母的最佳生長量。

1.3.2.1 不同水分含量對酵母生長量的影響

接種10%酵母w2種子液在水分含量（質(zhì)量分數(shù)）分別為5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%的酵母麩曲原料配方中。給予足夠的通氧量，放置25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h。

1.3.2.2 不同培養(yǎng)時間對酵母生長量的影響

采用10%接種量，水分含量為20%，麩曲原料配比同1.3.2.1。將接種好的酵母麩曲放置在25℃培養(yǎng)箱中，分別培養(yǎng) 12、24、36、48、60、72 h。

1.3.2.3 不同培養(yǎng)溫度對酵母生長量的影響

采用10%的接種量，水分含量為20%。將已接種的酵母麩曲分別放置于 12、16、20、24、28、32、36 ℃溫度的微生物培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)36 h。

1.3.3 酵母麩曲活菌計數(shù)方法

制作菌懸液：每個樣稱量10 g酵母麩曲加入裝有90 mL無菌9%生理鹽水的250 mL三角瓶中，于恒溫培養(yǎng)振蕩器中28℃、100 r/min振蕩30 min。菌液梯度稀釋：無菌操作，取5支已滅菌裝有9 mL 9%生理鹽水的試管，依次稀釋為 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6濃度的菌懸液，用移液管分別移取1 mL菌懸液逐級稀釋。涂布平板法：分別移取每個樣品10-6濃度的菌液1 mL于孟加拉紅平板培養(yǎng)基中，涂布后放置28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后，用菌落計數(shù)儀計數(shù)。

1.3.4 揮發(fā)性風味物質(zhì)檢測方法

酵母發(fā)酵液和酒液中揮發(fā)性風味物質(zhì)的檢測均采用此方法。固相微萃取條件：精確量取5 mL，55℃平衡10 min后萃取30 min。氣相色譜條件：DB-WAX 60.0 m×0.25 mm×0.25 μm毛細管色譜柱；進樣口溫度230℃；不分流；程序升溫，40℃保持1 min，5℃/min升到200℃，再以10℃/min升到230℃保持1 min；載氣為99.999%氦氣，載氣流速為1 mL/min。質(zhì)譜條件：電離電壓70 eV，離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，電離方式EI，質(zhì)量掃描范圍20 amu～500 amu，溶劑延遲3 min。

1.3.5 釀酒試驗

采用清香型小曲酒工藝，以2%的添加量，將最佳工藝酵母麩曲分別在糖化前（a）、糖化后（b）加入發(fā)酵糟中，以不加酵母麩曲為對照。工藝流程如下：

1.3.6 數(shù)據(jù)處理及圖像處理方法

試驗所得數(shù)據(jù)采用origin、Excel作圖，SPSS 20.0進行方差分析，多重比較采用Duncans新復(fù)極差法進行差異顯著性的分析，以P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 酵母w2揮發(fā)性風味代謝產(chǎn)物分析

對酵母w2液態(tài)發(fā)酵液進行代謝產(chǎn)物分析，如圖1所示。

酵母w2代謝的主要產(chǎn)物為酯類、醇類物質(zhì)，以乙酸乙酯、乙醇、苯乙醇、異戊醇、乙酸苯乙酯為主，相對含量分別為 49.008%、32.893%、6.619%、4.972%、2.928%。乙酸乙酯有水果香味，異戊醇有蘋果白蘭地和辛辣味，乙酸苯乙酯有甜蜜香味，苯乙醇有密香玫瑰味。酵母w2具有豐富的香甜味，可以應(yīng)用到相應(yīng)的酒等食品類，具有較高的風味價值。乙酸乙酯是清香型白酒的主體香，香味清新甜潤，此酵母如能應(yīng)用到清香型白酒中，能起到很好的提酯提味的效果，具有較高的應(yīng)用開發(fā)潛質(zhì)。

圖1 酵母w2代謝產(chǎn)物GC-MS離子流色譜Fig.1 The GC-MS ion chromatography of metabolite by yeast w2

2.2 酵母麩曲原料用量單因素試驗

張東平[11]對根霉酵母麩曲在白酒中的應(yīng)用所用到的原料配比為：麩皮50%，鮮酒糟30%，玉米粉20%。黃光建等[12]對香醅配料進行優(yōu)化，結(jié)果表明麩皮和鮮酒糟對酵母產(chǎn)酯的影響比較大，而玉米粉的影響不是太大。為了研究酵母w2在麩曲中應(yīng)用，以酵母活菌數(shù)為衡量指標，得到酵母w2麩曲的原料配比。

2.2.1 麩皮用量確定

麩皮富含淀粉、維生素及無機鹽等營養(yǎng)成分，且疏松多孔，有利于麩曲中酵母的生長代謝和通氧散熱等。本試驗對變量麩皮應(yīng)用到酵母麩曲的結(jié)果如圖2所示。

圖2 麩皮添加量對酵母活菌數(shù)的影響Fig.2 The influence of amount of bran to viable count of yeast w2

由圖2知，當麩皮添加量為6 g時，酵母活菌數(shù)顯著高于其他麩皮添加量，其數(shù)量為1.27×108CFU/g，相當于其他添加量活菌數(shù)的1.6倍左右，在其他添加量下無顯著差異。故可考慮酵母麩曲中麩皮用量占比為50%（6 g/12 g）。

2.2.2 鮮酒糟用量確定

鮮酒糟含有豐富的粗蛋白，同時還含有多種微量元素、維生素、氨基酸、還原糖等。將鮮酒糟應(yīng)用于酵母麩曲的原料中，可為酵母提供較為豐富的營養(yǎng)料。本試驗對變量鮮酒糟應(yīng)用到酵母麩曲的結(jié)果如圖3所示。

圖3 鮮酒糟添加量對酵母活菌數(shù)的影響Fig.3 The influence of amount of fresh distillers grains to viable count of yeast w2

由圖3知，隨著鮮酒糟添加量的增加，酵母活菌數(shù)逐漸增加；而隨著鮮酒糟添加量的繼續(xù)增加超過一定數(shù)量，酵母活菌數(shù)呈顯著下降趨勢，而鮮酒糟過剩（＞33.3%）會抑制部分酵母的生長。由此可知，一定量的鮮酒糟有利于酵母麩曲中酵母的生長。當鮮酒糟為4 g或5 g時，酵母活菌數(shù)無明顯差異性且最有利于酵母w2的生長，可考慮鮮酒糟添加量為25%（4 g/16 g）～29.4%（5 g/17 g）范圍內(nèi)。

2.2.3 玉米粉用量確定

酵母的生長繁殖需要一定的碳源，玉米粉在微生物發(fā)酵中主要起碳源的作用，其中玉米粉還含有較多的生長因子。劉曉明等[13]研究酵母對不同碳源（包括玉米粉、麩皮、豆面、葡萄糖）的利用效果，結(jié)果表明玉米粉對酵母發(fā)酵為最佳碳源。本試驗探究玉米粉用量對酵母生長的影響，試驗結(jié)果如圖4所示。

如圖4，少量的玉米粉有利于酵母麩曲中發(fā)酵的酵母生長，其酵母活菌數(shù)幾乎多了2倍。所以，玉米粉雖作為酵母必不可少的碳源，但只能是適量。當玉米粉的添加量達到4 g時，酵母活菌數(shù)最多，高達1.66×108CFU/g?？煽紤]酵母麩曲中原料玉米粉的占比為22%（4 g/18 g）。

綜上所述，考慮取酵母w2麩曲的原料配比為（以總質(zhì)量20 g計）：麩皮 50%（10 g），鮮酒糟 28%（5.6 g），玉米粉 22%（4.4 g）。

圖4 玉米粉添加量對酵母活菌數(shù)的影響Fig.4 The influence of amount of corn powder to viable count of yeast w2

2.3 酵母麩曲培養(yǎng)條件優(yōu)化

通常制曲講究培菌的工藝條件控制，一些主要的條件控制有溫度、水分、時間、通氧量等[14]。本試驗通過分別控制單因數(shù)的變量，探究酵母麩曲的質(zhì)量的最佳培菌工藝條件。

2.3.1 水分含量對酵母生長量的影響

水分是微生物生長繁殖發(fā)酵代謝必不可少的資源之一，通常較高的濕度會有利于酵母的生長[15]，但水分過多也會相應(yīng)的抑制微生物的生長。控制酵母麩曲的水分含量試驗結(jié)果如圖5所示。

圖5 水分含量對酵母活菌數(shù)的影響Fig.5 The influence of moisture content to viable count of yeast w2

如圖5所示，當麩曲中水分含量只有5%時，酵母的活菌數(shù)只有1.5×108CFU/g，顯著少于其他水分含量梯度的酵母量；隨著水分含量的增加，其活菌數(shù)顯著增加一倍并能維持在一定的數(shù)量；水分含量繼續(xù)升高，當達到35%時，酵母活菌數(shù)達到峰值。酵母麩曲中單因素水分含量控制在35%左右，更利于酵母的生長。

2.3.2 不同培養(yǎng)時間對酵母生長量的影響

對酵母麩曲培養(yǎng)時間的控制，得到的結(jié)果如圖6所示。

圖6 培養(yǎng)時間對酵母活菌數(shù)的影響Fig.6 The influence of time to viable count of yeast w2

由圖6可知，當酵母麩曲培養(yǎng)12 h時，酵母的生長很慢，隨著培養(yǎng)時間的增加，當達到24 h時，此時酵母活菌數(shù)顯著增加；培養(yǎng)時間繼續(xù)增加，麩曲中酵母數(shù)量下降并能維持在一定數(shù)量值上，此時酵母生長穩(wěn)定。培養(yǎng)時間為24 h左右，酵母w2生長良好。

2.3.3 不同培養(yǎng)溫度對酵母生長量的影響

微生物培養(yǎng)最講究控溫工藝，溫度為曲藥培菌的一大重要指標[16]。曲中各類微生物生長繁殖發(fā)酵代謝中溫度的變化，使得在制作過程中可大致知道此曲的發(fā)酵程度甚至認為控制發(fā)酵而提高其質(zhì)量。而酵母麩曲作為純種曲，其溫度的控制上較為容易。其培養(yǎng)溫度對酵母生長量的影響結(jié)果如圖7所示。

酵母w2生長所需溫度一般在16℃～36℃之間，故主要在低溫培菌期存活繁殖。如圖7所示，隨著溫度上升，麩曲中酵母的活菌數(shù)逐漸上升，當溫度達到28℃時，其活菌數(shù)最多可達到1.69×108CFU/g；隨著溫度的繼續(xù)上升，酵母菌數(shù)量顯著下降。培養(yǎng)溫度為28℃左右，酵母w2生長良好。

2.3.4 酵母麩曲培養(yǎng)條件正交優(yōu)化

對單因素培養(yǎng)條件試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，進行四因素三水平L9（34）正交優(yōu)化，以酵母麩曲中酵母w2活菌數(shù)為指標，進行正交數(shù)據(jù)分析，確定酵母麩曲的最佳培養(yǎng)條件，其分析結(jié)果如表1所示。

圖7 不同培養(yǎng)溫度對酵母活菌數(shù)的影響Fig.7 The influence of temperature to viable count of yeast w2

表1 酵母麩曲培養(yǎng)條件正交優(yōu)化Table 1 The orthogonal optimization of yeast bran koji culture conditions

由表1可知，水分含量、時間、溫度對酵母麩曲均有不同程度的影響。R值越大，代表了該因素的水平變化對酵母活菌數(shù)的影響較大，由極差分析得RA＞RC＞RB，其中水分和溫度2種因素水平變化引起的極差（11.300和4.667）大于空白列的誤差，說明對酵母麩曲中活菌數(shù)變化影響因數(shù)的主次順序是：水分＞溫度＞時間。對于 A 因素（水分）：K3＞K2＞K1，所以選 K3為 A 因素的優(yōu)水平；同理對于 B 因素（時間）：K1＞K3＞K2，所以選K1為 B 因素的優(yōu)水平；對于 C 因素（溫度）：K3＞K1＞K2，所以選K3為C因素的優(yōu)水平。故，理論上最佳培養(yǎng)方案為A3B1C3，即水分含量40%，培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)時間18 h。

2.4 酵母麩曲驗證試驗

對正交試驗結(jié)果進行驗證試驗，試驗結(jié)果如表2。

表2 酵母麩曲驗證試驗結(jié)果Table 2 The verification experiment result of yeast bran koji

由表2可知，在最佳理論培養(yǎng)條件下進行驗證試驗，得到理論最佳培養(yǎng)條件下酵母活菌數(shù)為（473±5.3）×106CFU/g，優(yōu)于此前的試驗結(jié)果，確定最佳培養(yǎng)方案為A3B1C3。在同培養(yǎng)條件下，比較試驗1、2號，酵母w2應(yīng)用于優(yōu)化麩曲配方（相比原配方），其酵母活菌數(shù)可達到（312±4.8×106）CFU/g，增長了 57.58%；在同麩曲配方下，比較試驗2、3號，優(yōu)化條件相比原條件，酵母活菌數(shù)增長了51.60%。綜上所述，酵母w2應(yīng)用于麩曲中，其最佳原料配比和最佳培養(yǎng)條件均可行。

2.5 應(yīng)用于清香型小曲酒釀酒試驗

將工藝優(yōu)化后的酵母麩曲，比較糖化24 h前、后的加入酵母麩曲進行發(fā)酵的小曲清香酒，將蒸餾后的酒液進行檢測，結(jié)果如圖8。

圖8 酵母w2的釀酒發(fā)酵試驗結(jié)果Fig.8 The results of fermentation test with the yeast w2

糖化前添加酵母麩曲使苯乙醇的量增加2倍，但總酯含量有所下降；糖化后添加酵母麩曲可使酒中的乙酸乙酯的含量提高3倍左右，總酯的含量提高2倍左右，苯乙醇含量無顯著變化。酵母麩曲在清香型小曲白酒發(fā)酵中的產(chǎn)香促進作用，特別在糖化后加入，效果更佳。

3 結(jié)論

將產(chǎn)乙酸乙酯的酵母w2應(yīng)用到清香型小曲白酒中，使原酒中乙酸乙酯和總酯含量得到明顯提高，清香風格更加突出。通過單因素試驗分析了不同原料和培養(yǎng)條件對酵母麩曲中活菌數(shù)的影響，并結(jié)合正交試驗設(shè)計優(yōu)化了培養(yǎng)條件，通過驗證試驗說明了優(yōu)化后原料配比和培養(yǎng)條件的可靠性，確定酵母麩曲的原料配比為：麩皮10 g、鮮酒糟5.6 g、玉米粉4.2 g；酵母麩曲的培養(yǎng)條件為：水分40%，培養(yǎng)時間18 h，培養(yǎng)溫度30℃。本試驗是建立在小試的基礎(chǔ)上初步探究酵母w2的麩曲制作工藝，但應(yīng)用效果明顯，為進一步探究提供了試驗數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。