徐清華，王娟，張鳳清，*

（1.長春工業(yè)大學化學與生命科學學院，吉林長春130012；2.長春市產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗院，吉林長春130012）

利用超高壓提取技術提取人參的有效成分，乙醇回流法提取麥冬、肉桂、枸杞子，提取浸膏輔以蜂蜜制備了一款抗疲勞酒，擬申報具有緩解體力疲勞作用的保健酒。參麥酒中人參起主要作用[1-4]，人參被我國衛(wèi)生部列為新資源食品[5]。超高壓提取可以提高有效成分的提取率[6-8]。衛(wèi)生部關于進一步規(guī)范保健食品原料管理的通知（衛(wèi)法監(jiān)發(fā)[2002]51號）中規(guī)定，肉桂和枸杞子為藥食兩用品種，麥冬為我國保健食品可用品種。根據(jù)我國《保健食品備案與注冊管理規(guī)定》的要求，保健食品申報必須進行毒理學安全性評價[9]，所以依據(jù)《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》（2003版）對復方人參保健酒的急性毒性和遺傳毒性進行了研究，以考察毒性級別和致突變作用，為注冊檢驗提供技術支撐，同時也為保健食品的申報和技術審評提供基礎研究資料。

1 材料和方法

1.1 受試物

參麥酒，規(guī)格：100 mL/（瓶·d）。60℃減壓濃縮成20.83倍濃縮液作為本次試驗受試樣品，受試樣品人體推薦劑量為4.80 mL/（人/d）。Ames試驗、微核試驗和小鼠精子畸形試驗均使用樣品20.83倍濃縮液。20.83倍濃縮液較稠，無法再度濃縮，高劑量組（人體推薦劑量100倍）采用酒基（50°）配制乙醇濃度無法調節(jié)到15%，故采用酒基（95°）調節(jié)各劑量組乙醇濃度至15%。

1.2 實驗動物

急性經(jīng)口毒性試驗選用健康成年SPF級ICR小鼠20只，雌雄各半，動物體重雌性為19.1 g～20.9 g，雄性為19.5 g～20.9 g，由揚州大學比較醫(yī)學中心提供，生產(chǎn)許可證號SCXK（蘇）2012-0004，合格證編號：201612900。微核試驗和小鼠精子畸形試驗均選用南京醫(yī)科大學醫(yī)藥實驗動物中心繁殖的SPF級ICR健康小鼠，生產(chǎn)許可證號SCXK（蘇）2016-0002。微核試驗小鼠合格證編號：201616159；小鼠精子畸形試驗小鼠合格證編號：201616161。

1.3 主要試劑與儀器

鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株TA97、TA98、TA100、TA102：Molecular Toxicology，Inc.；大鼠肝 S-9 勻漿：江蘇齊氏生物科技有限公司；DT-1000電子天平、JJ-100電子天平、AL104型電子天平：上海精密儀器儀表有限公司；顯微鏡：OLYMPUS；SG-603生物安全柜：美國BAKER；電熱恒溫培養(yǎng)箱、SX-700高壓滅菌器、THZ-312型恒溫搖床：常州首創(chuàng)儀器設備有限公司。

1.4 飼養(yǎng)條件

實驗動物在溫度為20.0℃～26.0℃、相對濕度為40%～70%的屏障系統(tǒng)中飼養(yǎng)。實驗動物使用許可證號：SYXK（蘇）2015-0009。輻照滅菌飼料由江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責任公司提供，生產(chǎn)許可證：蘇飼證（2014）01008。

1.5 試驗方法

1.5.1 急性經(jīng)口毒性試驗

用最大耐受量法進行小鼠急性毒性試驗，設計劑量為20 000 mg/kg bw。動物檢疫3 d，試驗前動物禁食16 d、自由飲水。樣品用無菌水配制，最大配制濃度為1 000 mg/mL，按最大灌胃量20 mL/kg bw，一次給樣，受試物給予劑量為20 000 mg/kg bw。給樣后連續(xù)觀察14 d，記錄中毒表現(xiàn)及死亡情況。

1.5.2 Ames試驗

采用標準平板摻入法，選鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株 TA97、TA98、TA100、TA102，經(jīng)鑒定合格后進行試驗?；罨到y(tǒng)為β-萘黃酮和苯巴比妥鈉誘導的大鼠肝S-9，S-9蛋白含量為30 mg/mL，其活力對2-氨基芴有良好的代謝激活能力。每100毫升S-9混合液中加10 mL S-9。陽性物：不加 S-9者為2，4，7-三硝基芴銅（TA97、TA98），甲基磺酸甲酯（TA100、TA102），加 S-9者為 2-氨基芴（TA97、TA98、TA100），1，8-二羥基蒽醌（TA102），同時設陰性對照組（未處理對照組和溶劑對照組）。在加與不加S-9混合液的情況下以5 000、1 000、200、40、8 μg/皿劑量進行試驗，每個劑量組做3個平皿。樣品置于0.103MPa條件下高溫滅菌20min，在無菌條件下，稱量受試樣品并配制成溶液，受試樣品用無菌水配制成50 mg/mL，即高劑量組，用無菌水按一定倍比逐級稀釋配制成 10、2、0.4、0.08 mg/mL 4個劑量組，加樣量均為0.1 mL/皿。在2 mL頂層瓊脂中加入0.1 mL試驗菌株增菌液、0.1 mL受試樣品溶液和0.5 mLS-9混合液（當需要代謝活化時）。混勻后倒入底層培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)48 h，計數(shù)每皿回變菌落數(shù)。如果受試樣品組的回變菌落數(shù)是陰性對照組回變菌落數(shù)2倍以上，并具有劑量-反應關系則為陽性。整個試驗在相同條件下重復做一次。

1.5.3 小鼠骨髓細胞微核試驗

選用體重25 g～30 g SPF級ICR小鼠60只，動物購買后適應環(huán)境3 d進行試驗。按體重隨機分為6個組，每組10只，雌雄各半。受試物人體推薦攝入量為：4.8 mL/（人/d）（體重按60 kg計），受試樣品人的推薦攝入量的100倍為：8.0 mL/kg bw，最高劑量設為8 mL/kg bw，設 2、4、8 mL/kg bw 3 個劑量組、陰性對照組（包括空白對照組：無菌水10 mL/kg·bw灌胃、溶劑對照組：含15%乙醇的酒基10 mL/kg bw灌胃）、陽性對照組（環(huán)磷酰胺，40 mg/kg bw腹腔注射）。根據(jù)樣品的溶解性選擇95°基酒和無菌水配制，并調整各劑量組乙醇濃度為15%，低、中、高劑量組分別含受試樣品濃度為20%、40%、80%，以10 mL/kg bw灌胃，采用30 h給受試物法。兩次給受試樣品間隔24 h，第二次給受試樣品后6 h處死動物，取胸骨常規(guī)制片、鏡檢，每鼠計數(shù)1 000個骨髓嗜多染紅細胞（polychromatic erythrocyte，PCE），觀察含微核的嗜多染紅細胞數(shù)并計算微核發(fā)生率，以千分率計，結果采用U檢驗進行統(tǒng)計處理。每鼠計數(shù)200個嗜多染紅細胞時所觀察到的成熟紅細胞數(shù)（normochromatic erythrocyte，NCE），并計算嗜多染紅細胞與成熟紅細胞比值（PCE/NCE）。

1.5.4 小鼠精子畸形試驗

選用體重25 g～35 g SPF級ICR性成熟雄性小鼠30只，動物購買后適應環(huán)境3 d進行試驗。按體重隨機分為6組，每組5只。設2、4、8 mL/kg bw 3個劑量組、陰性對照組（包括空白對照組：無菌水10 mL/kg bw灌胃、溶劑對照組：含15%乙醇的酒基10 mL/kg bw灌胃）、陽性對照組（環(huán)磷酰胺，40 mg/kg bw腹腔注射）。以10 mL/kg bw灌胃，每天1次，連續(xù)5 d。于首次給受試樣品后的第35天處死動物，取兩側附睪精子濾液按常規(guī)制片、鏡檢。每鼠計數(shù)1 000個結構完整的精子，計算精子畸形發(fā)生率（以百分率計），結果采用秩和檢驗進行統(tǒng)計處理。

1.6 結果判定與統(tǒng)計

急性經(jīng)口毒性試驗根據(jù)急性毒性劑量分級表對該受試物進行分級。微核試驗結果采用U檢驗進行統(tǒng)計處理，小鼠精子畸形試驗結果采用秩和檢驗進行統(tǒng)計處理。

2 結果

2.1 急性經(jīng)口毒性試驗

參麥酒對小鼠體重和死亡數(shù)的影響見表1。

表1 參麥酒對小鼠急性經(jīng)口毒性的影響（±s）Table 1 Effects of ginseng ophiopogon liquor on acute oral toxicity in mice（±s）

表1 參麥酒對小鼠急性經(jīng)口毒性的影響（±s）Table 1 Effects of ginseng ophiopogon liquor on acute oral toxicity in mice（±s）

性別 動物只數(shù)MTD/（mg/kg bw）雌 10 20.3±0.6 27.4±1.1 20 000 0 ＞20 000雄 10 20.2±0.5 33.2±1.3 20 000 0 ＞20 000體重/g 終體重/g 劑量/（mg/kg bw）初始 死亡只數(shù)

試驗觀察期間，各組動物飲食和活動正常，生長良好，未見任何中毒表現(xiàn)及死亡。

2.2 Ames試驗

參麥酒Ames試驗回變菌落數(shù)見表2、表3。

表2 第一次參麥酒Ames試驗回變菌落數(shù)（±s）Table 2 First time of ginseng ophiopogon liquor ames trial recall bacteria fall（±s）

表2 第一次參麥酒Ames試驗回變菌落數(shù)（±s）Table 2 First time of ginseng ophiopogon liquor ames trial recall bacteria fall（±s）

注：**超過陰性對照組菌落數(shù)2倍以上。

-S-9 TA97 TA98 TA100 TA102 TA97 TA98 TA100 TA102自發(fā)回變 0 mL 119±11 36±5 156±22 269±25 119±12 35±6 164±14 271±17無菌水 0.1 mL 114±14 34±7 148±19 287±12 121±11 36±5 165±16 276±12參麥酒 8 μg 119±17 37±6 167±20 279±25 107±10 35±6 166±11 274±25 40 μg 115±12 36±6 148±17 260±22 107±14 38±7 173±26 279±20組別 劑量（以每皿計）回變菌落數(shù)+S-9 200 μg 117±15 38±5 154±15 277±20 117±12 38±6 174±15 270±31 1 000 μg 119±13 38±4 165±18 290±10 125±15 39±4 164±17 269±26 5 000 μg 117±14 38±4 157±12 267±25 110±13 33±4 182±14 277±31 2-氨基芴 10 μL 1 145±121**3 532±197**2 874±107**1，8-二羥基蒽醌 50 μL 1 235±184**2，4，7-三硝基芴銅 0.2 μL 2 741±122** 2 625±143**甲基磺酸甲酯 1.0 μL 2 743±217** 3 295±194**

表3 第二次參麥酒Ames試驗回變菌落數(shù)（±s）Table 3 Second time of ginseng ophiopogon liquor ames trial count（±s）

表3 第二次參麥酒Ames試驗回變菌落數(shù)（±s）Table 3 Second time of ginseng ophiopogon liquor ames trial count（±s）

注：**超過陰性對照組菌落數(shù)2倍以上。

-S-9 TA97 TA98 TA100 TA102 TA97 TA98 TA100 TA102自發(fā)回變 0 mL 112±16 38±4 184±10 283±25 117±16 38±6 176±21 271±16無菌水 0.1 mL 108±10 37±5 167±20 276±19 116±16 38±4 168±16 263±27參麥酒 8 μg 116±14 34±7 173±19 286±17 121±14 38±4 144±16 265±18 40 μg 116±11 38±5 175±18 272±22 120±13 36±6 148±17 287±14組別 劑量（以每皿計）回變菌落數(shù)+S-9 200 μg 120±18 37±4 161±22 253±12 122±16 36±5 160±16 257±12 1 000 μg 121±12 36±6 169±28 262±19 113±19 37±5 172±23 273±16 5 000 μg 111±13 36±7 174±21 268±20 109±19 34±4 187±13 273±29 2-氨基芴 10 μL 1 218±182**3 367±163**2 680±177**1，8-二羥基蒽醌 50 μL 1 265±108**2，4，7-三硝基芴銅 0.2 μL 2 717±80** 2 645±132**甲基磺酸甲酯 1.0 μL 2 383±172**3 427±151**

受試樣品溶液、溶劑對照、緩沖液以及S9混合物在無菌平板上均未觀察到受污染的菌落。各劑量組回變菌落數(shù)均未超過陰性對照組回變菌落數(shù)的2倍，亦無劑量-反應關系。即參麥酒對鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102 4株試驗菌株，在加與不加S-9時，均未見有致基因突變作用。

2.3 小鼠骨髓細胞微核試驗

參麥酒對小鼠骨髓細胞微核發(fā)生率和嗜多染紅細胞與成熟紅細胞比值（PCE/NCE）的影響見表4。

表4 參麥酒對小鼠骨髓細胞微核發(fā)生率和嗜多染紅細胞與成熟紅細胞比值（PCE/NCE）的影響Table 4 Effect of ginseng ophiopogon liquor on the incidence of micronucleus and the ratio of polychromatic erythrocyte to mature red blood cell（PCE/NCE）in bone marrow cells of mice

由表4可見，各劑量組微核率與陰性對照組比較無顯著性差異（P＞0.05），而陽性對照組高于陰性對照組，有顯著性差異（P＜0.05）。受試物各劑量組的嗜多染紅細胞與成熟紅細胞比值（PCE/NCE）與對照組的差異均在對照組20%以內，受試物對骨髓細胞增殖沒有抑制作用。未見參麥抗疲勞酒對小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核形成及嗜多染紅細胞與成熟紅細胞比值（PCE/NCE）產(chǎn)生影響。

2.4 小鼠精子畸形試驗

參麥酒對小鼠精子畸形率的影響見表5。參麥酒對小鼠精子畸形類型及比例的影響見表6。

表5 參麥酒對小鼠精子畸形率的影響Table 5 Effect of ginseng ophiopogon liquor on sperm abnormality of mice

表6 參麥酒對小鼠精子畸形類型及比例的影響Table 6 Effect of ginseng ophiopogon liquor on type and proportion of sperm abnormalities in mice

由表5、表6可見，各劑量組精子畸形率與陰性對照組比較，無顯著性差異（P＞0.05），而陽性對照組小鼠精子畸形率高于陰性對照組，有顯著差異（P＜0.05）。因此參麥酒對小鼠精子畸形率未產(chǎn)生影響。

3 結論與討論

《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》2003版規(guī)定了保健食品安全性毒理學評價的4個階段和內容，按照不同保健食品選擇毒性試驗的原則要求，本實驗受試物有一個原料是新資源食品，兩個原料可藥食兩用，一個原料可以用做保健食品原料，故應該進行第一階段和第二階段的毒理學安全性評價。第一階段小鼠最大耐受劑量（maximumtolerateddose，MTD）20000mg/kgbw，大于15 g/kg，按食品急性毒性劑量分級標準判斷，受試物屬于無毒。通過致突變實驗可以對受試物的遺傳毒性進行考察，遺傳毒性的試驗組合應該綜合考慮原核細胞和真核細胞、生殖細胞和體細胞、體內試驗和體外試驗相結合的原則，本研究選用了Ames試驗（細菌致突變試驗）、小鼠骨髓細胞微核實驗、小鼠精子畸形實驗作為第二階段遺傳毒性檢測。結果，3項試驗試驗結果為陰性。表明本實驗條件下本受試物無遺傳毒性。

相關文獻報道了人參、肉桂、麥冬、枸杞子單味藥材的毒性研究[10-19]。參麥酒無急性毒性和遺傳毒性，與其中單味藥的文獻報道一致。

朱薇薇[20]以高粱酒、海貍鼠肝（獺肝）、枸杞、制首鳥、蜂蜜、肉桂、甘草、山艾肉、龍眼肉、人參、牡蠣、丁香、海貍鼠鞭（獺鞭）為主要原料制成了三棟健酒，并對其進行安全性毒理學試驗，結果未觀察到有毒副作用。洪麗華等[21]研究參杞紅瑪膠囊的急性毒性和遺傳毒性，參杞紅瑪膠囊由人參、枸杞、紅景天、瑪卡、淫羊藿等組成，在實驗條件下，參杞紅瑪膠囊屬無毒級，未見遺傳毒性。人參、肉桂、麥冬、枸杞子四味藥材加以蜂蜜制成酒劑聯(lián)合毒性作用未見報道。本研究證實了參麥酒屬無毒級，未顯示致突變作用。研究結果為參麥酒注冊檢驗提供實驗依據(jù)，同時為保健食品申報提供毒理學基礎研究。