李青青，張潤(rùn)敏，石冠藍(lán)，姚攀鋒，王曉麗，李成磊

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川雅安 625014）

黃酮類(lèi)化合物是一類(lèi)廣泛存在與植物中的多酚類(lèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物，主要包括黃酮、黃酮醇和花青素等幾大類(lèi)。其中，黃酮醇化合物所占比例最大，約1/3左右，達(dá)2 000余種[1]。研究表明，黃酮醇不僅在植物中具有抵御紫外線(xiàn)傷害、抗寒抗旱、提高花粉萌發(fā)、促進(jìn)花粉管發(fā)育等作用[2-6]，在醫(yī)藥方面也具有多種功效如抗氧化抗衰老、抗炎、降糖降脂等[7-12]。

黃酮醇合酶（flavonol synthase，F(xiàn)LS，EC 1.14.11.23）是植物黃酮醇生物合成的關(guān)鍵酶，屬于α-ODD家族黃酮醇合酶，催化二氫黃酮醇C3位發(fā)生羥基化生成黃酮醇[4]。1985年L.Britsch等[13]首先從受輻射的歐芹體外細(xì)胞提取物中檢測(cè)到二氫黃酮醇轉(zhuǎn)變?yōu)辄S酮醇；1993年T.A.Hoton等[14]首次從矮牽牛中分離得到FLS編碼基因，隨后在馬鈴薯、金魚(yú)草等物種中也分離得到FLS基因[15-16]；這些研究表明，F(xiàn)LS由多拷貝基因編碼且在不同植物中拷貝數(shù)不同，其表達(dá)量和底物偏愛(ài)性等與黃酮醇含量和分布等密切相關(guān)[17-20]。A.Fujita等[21]從葡萄中分離出5個(gè)VvFLS同源基因，VvFLS1-5在花中均有表達(dá)，VvFLS2、VvFLS4和VvFLS5在果皮也有表達(dá)，但只有VvFLS4能影響黃酮醇的合成。M.Mahajan等[22]研究發(fā)現(xiàn)在煙草中FLS基因轉(zhuǎn)錄后沉默不僅導(dǎo)致黃烷-3-醇含量升高、花青素含量降低，同時(shí)也導(dǎo)致煙草開(kāi)花延遲、結(jié)實(shí)率嚴(yán)重下降。由此可見(jiàn)，F(xiàn)LS不僅直接影響黃酮醇的合成，對(duì)其他黃酮類(lèi)化合物的積累以及植物某些生理特征也有很重要的影響[23]。

苦蕎（Fagopyrum tataricum）學(xué)名韃靼蕎麥，是一種藥食兩用小雜糧[24]。其生物活性成分主要為黃酮類(lèi)化合物，其中屬于黃酮醇類(lèi)的蘆丁含量最高，約占總黃酮的80%[25]。由于苦蕎食品和保健品日益受到廣大消費(fèi)者的青睞，使得苦蕎黃酮代謝研究也成為植物次生代謝的熱點(diǎn)之一。目前，苦蕎黃酮醇合酶的同源基因FtFLS1、FtFLS2和FtFLS3已被克隆，且對(duì)其抗非生物脅迫及酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析，表明這些基因的表達(dá)特征和酶學(xué)特征都有所不同[26-27]。隨著苦蕎轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)的日益豐富，可能會(huì)有更多的黃酮醇合酶同源基因被發(fā)現(xiàn)。本研究基于苦蕎花期轉(zhuǎn)錄組，篩選獲得一條注釋為黃酮醇合酶的新基因序列FtFLS4，通過(guò)RT-PCR技術(shù)克隆該基因，并采用生物信息學(xué)分析其編碼蛋白的分子特征，構(gòu)建其重組原核表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌中的表達(dá)，進(jìn)而采用薄層層析技術(shù)對(duì)其表達(dá)產(chǎn)物的催化活性進(jìn)行了初步鑒定。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

苦蕎（“西蕎二號(hào)”）種植于四川省雅安市四川農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)基地。大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)和原核表達(dá)載體pET-30b(+)由本實(shí)驗(yàn)室保存，其他藥品為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因克隆

通過(guò)對(duì)苦蕎轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的篩選，成功獲得5條含有完整ORF框的FtFLS基因，其cDNA序列長(zhǎng)度均為1 000 bp左右。其中FtFLS1-3基因已被成功克隆[27]，剩余2條FtFLS基因其中一條基因表達(dá)量在各組織中明顯高于另一條，為鑒定其功能并進(jìn)一步研究苦蕎黃酮醇合酶，對(duì)該基因進(jìn)行克隆并命名為FtFLS4。

采用改良SDS法[28]提取苦蕎花期總DNA。采用RNAout試劑盒（天澤基因工程有限公司）提取苦蕎花期總RNA，以其為模板通過(guò)Revert AidTM First Strand Cdna Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas公司）制備cDNA第一鏈。根據(jù)苦蕎轉(zhuǎn)錄組設(shè)計(jì)引物（見(jiàn)表1）。以花期苦蕎cDNA及總DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：cDNA模板1 μL，上下游引物各 1.5 μL，高保真 DNA 聚合酶（Prime STAR HS Polymerase，TaKaRa）12.5 μL 及無(wú)菌去離子水8.5 μL。反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性1 min；98℃變性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。按照DNAA-Tailing Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行加A后克隆到pMD 19-T Simple Vector，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子測(cè)序。

1.2.2 生物信息學(xué)分析

利用DNAman 8.0拼接測(cè)序結(jié)果，分析苦蕎FtFLS4基因內(nèi)含子和外顯子，并推導(dǎo)其氨基酸序列。利用Clustal X對(duì)FtFLS4基因編碼蛋白進(jìn)行多重序列比對(duì)，從NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上下載其他植物黃酮醇合酶序列，采用MEGA5.0軟件根據(jù)鄰接法，重復(fù)1 000次構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。采用SOMPA預(yù)測(cè)氨基酸序列二級(jí)結(jié)構(gòu)，并使用ExPASy（http：//web.expasy.org/protparam/）在線(xiàn)軟件對(duì)其進(jìn)行分子量及等電點(diǎn)預(yù)測(cè)。利用蛋白質(zhì)建模軟件SWISS-Model建立蛋白質(zhì)模型，并使用Discovery Studio 2.5對(duì)接程序?qū)tFLS4蛋白模型與3種底物進(jìn)行分子對(duì)接，底物的三維結(jié)構(gòu)由chEBI（http：//www.ebi.ac.uk/chebi/init.do）數(shù)據(jù)庫(kù)下載[二氫槲皮素（ChEBI：17948）、二氫山奈酚（ChEBI：15404）和二氫楊梅素（ChEBI：28429）]。

表1 基因克隆及表達(dá)載體引物序列Table 1 Primers used for gene cloning and expression vector

1.2.3FtFLS4基因的原核表達(dá)及蛋白純化

以含F(xiàn)tFLS4基因的T載體質(zhì)粒為模板，用引入酶切位點(diǎn)的引物（見(jiàn)表1）進(jìn)行PCR反應(yīng)，將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到原核表達(dá)載體pET-30b(+)。將pET-30b(+)-FtFLS4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株E.coliBL21(DE3)，挑取單菌落接種到10 mL液體LB培養(yǎng)基中（含卡那霉素）37℃過(guò)夜培養(yǎng)。按2%接種量接種于50 mL液體LB培養(yǎng)基（含卡那霉素），37℃培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8，加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）至終濃度為0.4 mmol/L，22℃誘導(dǎo)6 h。收集菌體后按照His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒His-Tagged Protein Purification Kit（康為世紀(jì)生物科技有限公司）的操作步驟進(jìn)行蛋白分離純化。

1.2.4 重組FtFLS4的催化活性鑒定

采用薄層層析技術(shù)（TLC）對(duì)酶的活性進(jìn)行定性分析。參照Li C.[7]的方法，反應(yīng)體系（總體積500 μL）中包括100 μmol/L底物（二氫槲皮素、二氫山奈酚、二氫楊梅素），111 mmol/L 乙酸鈉，83 μmol/Lα-酮戊二酸，42 μmol/L 硫酸鐵，2.5 mmol/L 維生素 C（pH 5.0），約 12.5 μg純化蛋白，37℃反應(yīng) 20 min后用等體積乙酸乙酯萃取，進(jìn)行薄層層析定性分析。依照中國(guó)藥典進(jìn)行TLC檢測(cè)[29]，以二氫黃酮醇、黃酮醇及兩者混合物為對(duì)照，將反應(yīng)萃取物點(diǎn)樣于羧甲基纖維素鈉硅膠G薄層板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸=5∶2∶2為展層劑進(jìn)行展層，碘蒸氣顯色并計(jì)算各斑點(diǎn)的Rf值。

采用分光光度法對(duì)酶的活性進(jìn)行定量分析。將不同質(zhì)量濃度（0.5、1、2、3、5、7、9、12 和 15 μg/mL）的槲皮素、山奈酚和楊梅素溶于反應(yīng)緩沖液中，利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（Shimadz，Japan）測(cè)得其吸光度并以此建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。將酶促反應(yīng)液于對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算產(chǎn)物生成量進(jìn)而計(jì)算比活力。酶活力單位采用國(guó)際酶單位（IU），即每分鐘生成1 μmol產(chǎn)物。

2 結(jié)果與分析

2.1 FtFLS4基因的克隆及序列分析

以苦蕎花期總cDNA及DNA為模板，用引物FtFLS4f和FtFLS4r進(jìn)行PCR擴(kuò)增后分別獲得1條約1 000 bp的特異條帶。測(cè)序結(jié)果顯示，獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物分別為1 026 bp和1 126 bp。序列分析表明，苦蕎FtFLS4cDNA序列包含1個(gè)1 026 bp的ORF，編碼341個(gè)氨基酸殘基；DNA序列為1 126 bp，外顯子與cDNA序列一致，包含1個(gè)100 bp的內(nèi)含子，其序列符合GT-AG剪接規(guī)則（見(jiàn)圖1）。

圖1 苦蕎FtFLS4的基因結(jié)構(gòu)Figure 1 Gene structures of FtFLS4 of tartary buckwheat

Protparam在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)推導(dǎo)的FtFLS4蛋白理論分子量大小為39.2 kDa，等電點(diǎn)（pI）為5.79。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，F(xiàn)tFLS4主要由α-螺旋（36.95%）、β-轉(zhuǎn)角（6.74%）、β-片層（22.58%）以及無(wú)規(guī)則卷曲（33.72%）組成。將苦蕎FtFLS4的氨基酸序列與苦蕎其他4條FtFLS序列（FtFLS1：GenBank ID AEC33116.1，F(xiàn)tFLS2：GenBank ID AGE13752.1）及甜蕎（GenBank ID：AEC33115.1）、金蕎（GenBank ID：AHN19765.1）、擬南芥（GenBank ID：CAP09052.1）、葡萄（GenBank ID：BAE75810.1）和草莓（GenBank ID：ABH07784.1）的FLS序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示，F(xiàn)tFLS4具有α-ODD家族保守功能區(qū)域[30]（conserved domain A和conserved domain B）及Fe2+和α-酮戊二酸結(jié)合位點(diǎn)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建結(jié)果顯示，該進(jìn)化樹(shù)主要聚為3簇：第I簇由苦蕎FtFLS1、FtFLS3及甜蕎、金蕎、荷蘭芹等雙子葉植物FLS聚成，Li C.等[7]研究表明FtFLS1在三級(jí)結(jié)構(gòu)N-末端含有第1個(gè)α-螺旋，具有酶催活性；第Ⅱ簇由擬南芥AtFLS1-6及紫羅蘭和裸莖條果芥FLS聚成，均屬十字花科植物，其中AtFLS1-6中僅有AtFLS1和AtFLS3具有酶催活性，其他4個(gè)因三級(jí)結(jié)構(gòu)N-末端缺失第1個(gè)α-螺旋而喪失活性[17]；第Ⅲ簇由苦蕎FtFLS2、FtFLS4及裸子植物銀杏、單子葉植物玉米和大麥、雙子葉植物茶樹(shù)和葡萄的FLS聚成，研究表明玉米ZmFLS在三級(jí)結(jié)構(gòu)N-末端也含有第1個(gè)α-螺旋且具有酶催活性[19]。本研究中苦蕎FtFLS4與玉米親緣關(guān)系最近，表明其可能具有相似的功能；此外與苦蕎其他FLS雖來(lái)源于同一物種，但卻處于不同的兩大簇，進(jìn)化上出現(xiàn)了分化，推測(cè)其酶催活性等功能可能存在差異。

圖2 苦蕎FtFLS4編碼蛋白的多重序列比對(duì)Figure 2 Amino acid sequence alignment of tartary buckwheat FtFLS4 with FLSs in others plants

圖3 不同植物FLS氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Figure 3 Phylogenetic tree based on amino acid sequence encoded by FLS gene in different plant species

2.2 FtFLS4編碼蛋白模型及分子對(duì)接

利用蛋白質(zhì)建模軟件SWISS-MODEL，以擬南芥無(wú)色花青素雙加氧酶（leucoanthocyanidin dioxygenase，LDOX）結(jié)晶結(jié)構(gòu)為模板建立FtFLS4的蛋白模型，并將蛋白模型與3種二氫黃酮醇進(jìn)行分子對(duì)接（見(jiàn)圖4）。FtFLS4為球狀蛋白，其底物結(jié)合位點(diǎn)位于蛋白質(zhì)表面且主要由短序列的α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲形成活性中心口袋，其中His215、Asp217和His272為Fe2+離子結(jié)合位點(diǎn)，Arg282和Ser284為α-酮戊二酸結(jié)合位點(diǎn)。在FtFLS4-DHQ模型中，Gln219和Gln196與二氫槲皮素分子形成氫鍵；FtFLS4-DHK模型中，Asp217、Gln219和Gln196與二氫山奈酚分子形成氫鍵；FtFLS4-DHM 模型中，Thr216、Arg194、Gln219和 Gln196與二氫楊梅素分子形成氫鍵。Gln219、Tyr218、His215、Arg194和 Phe288等氨基酸殘基提供疏水性環(huán)境和電子拉鏈以穩(wěn)定酶促反應(yīng)微環(huán)境。分子對(duì)接結(jié)果顯示FtFLS4通過(guò)活性中心的氨基酸殘基可與3種二氫黃酮醇形成酶-底物復(fù)合物，推測(cè)該蛋白可能具有酶催活性。

圖4 苦蕎FtFLS4的同源建模及分子對(duì)接Figure 4 The homology modeling and molecular docking of FtFLS4

2.3 FtFLS4基因在大腸桿菌中的表達(dá)

含有pET-30b(+)-FtFLS4重組質(zhì)粒的大腸桿菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，對(duì)表達(dá)蛋白產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析，見(jiàn)圖5。結(jié)果表明，誘導(dǎo)后的基因工程菌可見(jiàn)一條約40 kDa的新生帶，與理論相對(duì)分子質(zhì)量一致。重組蛋白主要以可溶狀態(tài)表達(dá)，且表達(dá)量隨誘導(dǎo)時(shí)間逐漸增加。表達(dá)蛋白經(jīng)His-tag親和層析純化后獲得了條帶單一的融合表達(dá)酶蛋白，可用于后續(xù)酶催活性鑒定。

2.4 FtFLS4表達(dá)蛋白的酶催活性鑒定

采用薄層層析法對(duì)FtFLS4表達(dá)蛋白酶促反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定（見(jiàn)圖6）。FtFLS4的酶促反應(yīng)液樣品均在接近黃酮醇標(biāo)準(zhǔn)品（槲皮素、楊梅素和山奈酚）的位置新出現(xiàn)一個(gè)斑點(diǎn)。二氫槲皮素和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品Rf值分別為0.16和0.27；二氫楊梅素和楊梅素標(biāo)準(zhǔn)品Rf值分別為0.11和0.18；二氫山奈酚和山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品Rf值分別為0.28和0.37。而FtFLS4的3種酶促反應(yīng)液中兩種物質(zhì)的Rf值均與標(biāo)準(zhǔn)品接近。結(jié)果表明，F(xiàn)tFLS4具有催化3種二氫黃酮醇轉(zhuǎn)化為黃酮醇的催化活性。此外，酶學(xué)活性測(cè)定表明，重組FtFLS4蛋白以二氫槲皮素、二氫山奈酚和二氫楊梅素為底物，其比活力分別為25.19×10-3、48×10-3和 19.04×10-3IU/mg。

圖5 FtFLS4在大腸桿菌中的表達(dá)分析Figure 5 SDS-PAGE analysis of FtFLS4 expressed in E.coli

圖6 苦蕎黃酮醇合酶FtFLS4酶催活性的薄層層析鑒定Figure 6 Activity identification for tartary buckwheat FtFLS4 with thin layer chromatography

3 討論與結(jié)論

黃酮醇合酶是黃酮類(lèi)化合物代謝途徑的關(guān)鍵酶，其催化二氫黃酮醇生成黃酮醇，對(duì)植物黃酮醇和花青素的合成及積累都有重要影響[14]。FLS屬于α-同戊二酸依賴(lài)性雙加氧酶（α-oxoglutaratedependent dioxygenase，α-ODD）家族的成員，該家族還包括黃酮類(lèi)化合物合成途徑的黃烷酮-3-羥化酶（flavanone-3-hydroxylase，F(xiàn)3H）、黃酮合酶（flavone synthase，F(xiàn)NS）和花青素合酶（anthocyanidin synthase，ANS）[31]。研究表明，α-ODD 基因都含有 2 個(gè)高度保守的功能區(qū)域，及α-酮戊二酸和Fe2+結(jié)合位點(diǎn)（Arg-X-Ser，His-Asp-His），推測(cè)可能與酶生物活性相關(guān)[32]。本研究所得FtFLS4含有α-ODD中2個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域和相關(guān)活性位點(diǎn)（His215、Asp217和His272為 Fe2+離子結(jié)合位點(diǎn)，Arg282和 Ser284為α-酮戊二酸結(jié)合位點(diǎn)）。因此，從分子結(jié)構(gòu)上推測(cè)，F(xiàn)tFLS4可能具有黃酮醇合酶應(yīng)具有的催化功能。同時(shí)，F(xiàn)tFLS4與3種二氫黃酮醇的分子對(duì)接分析結(jié)果也進(jìn)一步支持上述推測(cè)。

植物FLS屬于多拷貝基因，例如擬南芥有6個(gè)拷貝，玉米有 3 個(gè)拷貝，柑橘有 5 個(gè)拷貝[17，19，32]。已有研究表明，苦蕎FtFLS基因也存在多拷貝[33]，并已分離克隆了3個(gè)FtFLS同源基因[27]。不同拷貝之間編碼的氨基酸序列上雖有著較高相似性，但三維結(jié)構(gòu)卻存在差異，這些差異最終導(dǎo)致彼此之間有著不同的酶學(xué)活性及催化特征。擬南芥FLS基因的6個(gè)拷貝中，僅有AtFLS1和AtFLS3編碼蛋白具有催化活性，其他4個(gè)拷貝由于三級(jí)結(jié)構(gòu)N-末端第一個(gè)α-螺旋缺失導(dǎo)致其活性喪失。其中，AtFLS1能有效催化擬南芥中黃酮醇的合成，而AtFLS3有著寬松的底物選擇性[17]。柑橘CuFLS[31]都趨向于催化二氫山奈酚，而玉米ZmFLS1[19]卻更加偏愛(ài)二氫槲皮素。本研究表明，苦蕎FtFLS1與FtFLS3與同屬蓼科植物的金蕎和甜蕎，親緣性最近，F(xiàn)tFLS2與雙子葉植物葡萄和茶樹(shù)親緣關(guān)系最近，而FtFLS4與單子葉植物玉米和大麥親緣性最近，說(shuō)明苦蕎FtFLS同源基因在進(jìn)化過(guò)程中出現(xiàn)分化，其編碼蛋白的催化活性和底物特異性可能存在差異。盡管通過(guò)大腸桿菌表達(dá)的苦蕎FtFLS1-4對(duì)3種二氫黃酮醇均表現(xiàn)出催化活性，但FtFLS1和FtFLS2對(duì)二氫槲皮素具有底物偏愛(ài)性，而FtFLS3和FtFLS4則更偏愛(ài)二氫山奈酚[27]?？梢?jiàn)，苦蕎中的黃酮醇合酶基因及其編碼蛋白在進(jìn)化和功能上具有多樣性。

目前，苦蕎基因組測(cè)序已經(jīng)完成[34]，這使得在基因組尺度上的黃酮合酶基因進(jìn)化分析和功能鑒定成為可能，可望進(jìn)一步加深對(duì)苦蕎黃酮醇合成、調(diào)控及其對(duì)發(fā)育和抗逆生理的理解。