朱軼鋒，韓順順，張克英，尹華東*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)所，成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，成都 611130）

隨著物質(zhì)生活水平的不斷提高，人們對雞肉的需求已經(jīng)從數(shù)量上追求轉(zhuǎn)變?yōu)橘|(zhì)量上滿足。為降低肉雞規(guī)模化、集約化養(yǎng)殖帶來的疫病影響，越來越密集的免疫程序以及藥物濫用導(dǎo)致雞肉中藥物和抗生素殘留不斷增加，動物機體耐藥性日益升高，對生態(tài)環(huán)境帶來了深層次污染，更對人類健康造成威脅。尋找安全、環(huán)保、高效的免疫調(diào)節(jié)劑代替?zhèn)鹘y(tǒng)藥物已成為畜牧業(yè)關(guān)注的熱點[1]。

近年來的大量研究證明，中藥多糖尤其是補益類多糖可提高機體免疫器官質(zhì)量，增強動物機體免疫功能，且具有安全、無毒、無殘留等優(yōu)點，是一類優(yōu)良的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑[2-3]。因此，采用多糖類天然產(chǎn)物來提高動物免疫能力，減少免疫次數(shù)，降低藥物殘留，越來越受到畜牧行業(yè)的重視。

黃芪是常用的扶正固本，補中益氣類中草藥。黃芪多糖（Astragaluspolysaccharides，APS）是從黃芪根部分離出的多糖物質(zhì)，為發(fā)揮其免疫增強作用的主要成分。黃芪多糖可調(diào)節(jié)動物血壓和血糖，增強機體免疫力，還具有抗病毒、抗氧化、防衰老的作用[4-5]。大量研究表明，黃芪多糖可激活機體內(nèi)淋巴細(xì)胞，引起特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)，還可激活巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞以及誘導(dǎo)分泌細(xì)胞因子從而激活非特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)[6-8]。

現(xiàn)代中藥藥理學(xué)研究表明，中藥對動物的免疫調(diào)節(jié)具有濃度效應(yīng)，只有在最適濃度下才能發(fā)揮最佳功效，且針對不同動物機體，可表現(xiàn)出相異的促進或抑制免疫作用[9]。因此，本試驗以不同濃度的APS處理體外培養(yǎng)的雛雞外周血、胸腺、脾臟以及法氏囊淋巴細(xì)胞，通過MTT比色法檢測不同淋巴細(xì)胞體外增殖情況，以及采用ELISA和RT-qPCR分別檢測脾臟淋巴細(xì)胞中細(xì)胞因子IL-2、TNF-β、IFN-γ、IL-4、IL-6含量及其相關(guān)基因 mRNA 表達量，旨在從細(xì)胞水平和分子水平探討黃芪多糖對家禽的免疫調(diào)節(jié)機制，為其在優(yōu)質(zhì)雞生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1日齡ROSS 308肉雞，購買于四川玉冠農(nóng)業(yè)有限公司。黃芪多糖購買于某動物藥業(yè)公司，純度98.5%。采用不含小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液溶解 APS，分別配制濃度為 20、40、80、160 以及320 μg/mL的APS溶液，微孔濾膜過濾器除菌后，4℃保存待用。

1.2 試驗方法

1.2.1 外周血、胸腺、法氏囊以及脾臟淋巴細(xì)胞的分離與制備

在7日齡選取健康雛雞6只，心臟無菌采血5 mL，肝素鈉抗凝后1∶1（V/V）加入40%percoll分層液（Pharmacia公司），再加入70%percoll分層液，3 000 r/min離心15 min，小心吸取兩層之間的白色單核淋巴細(xì)胞層吸出，Hanks液洗3次（每次1 000 r/min，離心5min）后加入RPMI-1640完全培養(yǎng)液（GIBCO公司），細(xì)胞濃度為2×106個/mL，采用臺盼藍染色檢測細(xì)胞存活率。

雞頸部靜脈放血致死，新潔爾滅溶液浸泡3 min，無菌取出胸腺、法氏囊和脾臟，PBS沖洗3次后剔除脂肪組織和包膜，放入裝有Hanks液的器皿中剪碎。用滅菌后的玻璃試管底部在100目的細(xì)胞篩網(wǎng)上研磨過濾，收集細(xì)胞懸液于40%percoll分層液中，再緩慢加入到70%percoll分層液之上，3 000 r/min離心15min，小心將兩側(cè)白色的單核淋巴細(xì)胞層吸出，后操作步驟同上。

1.2.2 淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)及增殖情況測定

用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板進行淋巴細(xì)胞的體外培養(yǎng)。將50 μL細(xì)胞培養(yǎng)液、50 μL濃度為5 μg/mL的有絲分裂原（刀豆蛋白液，ConA）以及50 μL不同濃度（20、40、80、160、320 μg/mL）APS，對照組加入 50 μL RPMI-1640培養(yǎng)液（APS濃度為 0 μg/mL），每個處理設(shè)置3個重復(fù)。將混合液輕微震蕩混勻，放置于37℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，每孔加入10 μL MTT后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，2 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入相同量不含雞血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，同時每孔添加10 mg/mL MTT溶液10 μL，振蕩混勻后繼續(xù)培養(yǎng)4 h。隨后，每孔加入100 μL DMSO，充分振蕩混勻后靜置20 min，用酶聯(lián)免疫檢測儀（Bio-RAD iMark）在570 nm波長處測定吸光度值（OD值）以判定細(xì)胞的增殖程度。

1.2.3 脾臟淋巴細(xì)胞中細(xì)胞因子含量的測定

脾臟淋巴細(xì)胞培養(yǎng)及處理同上，收集培養(yǎng)48 h后的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA試劑盒（上海博谷生物）測定脾臟淋巴細(xì)胞淋巴因子IL-2、IL-4、IL-6、TNF-β以及IFN-γ的含量，具體測定過程按試劑盒提供的說明書進行操作。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度及對應(yīng)OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在直線回歸方程上計算出相對應(yīng)的樣品濃度。

1.2.4 細(xì)胞RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及熒光定量檢測

采用RNAiso Plus（TaKaRa）試劑按照說明書提取淋巴細(xì)胞總RNA，DNaseⅠ純化處理后，1%瓊脂糖凝膠和Nanodrop ND-1000檢測RNA的完整性和濃度，隨后采用PrimeScriptTMRT反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

采用Smart Cycler II（Cepheid）實時PCR系統(tǒng)進行基因?qū)崟r定量擴增，反應(yīng)總體系25 μL，包括滅菌的 ddH2O 8.5 μL，cDNA 模板 2 μL，上下游引物（表 1）各 1 μL（10 μmol/L），SYBRPremix Ex TaqTM-Ⅱ（2×）12.5 μL。采用兩步法PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，共40個循環(huán)。選用GAPDH作為內(nèi)參基因，2-ΔΔct法計算基因相對表達量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)以均值標(biāo)準(zhǔn)誤表示，SPSS18.0軟件中的One-way ANOVA進行方差分析，Duncan’s法進行多重比較，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

表1 熒光定量PCR引物Table 1 Primers sequences of RT-qPCR

2 結(jié)果與分析

2.1 APS顯著影響雞不同組織淋巴細(xì)胞體外增殖

由表1可知，與對照組相比，添加濃度為20 μg/m的APS對外周血、胸腺、法氏囊以及脾臟淋巴細(xì)胞體外增殖沒有影響（P＞0.05）。當(dāng)APS濃度增加到40 μg/m以上，除胸腺外，外周血、法氏囊以及脾臟淋巴細(xì)胞各處理組OD值均顯著高于對照組（P＜0.05）。外周血淋巴細(xì)胞的OD值在160 μg/m和320 μg/m的APS處理組之間沒有差異（P＞0.05）；在法氏囊和脾臟淋巴細(xì)胞中，160 μg/m處理組的OD值顯著高于 320 μg/m處理組（P＜0.05）。80 μg/m及以上濃度APS處理顯著提高胸腺淋巴細(xì)胞OD值（P＜0.05），其中160 μg/m APS效果最佳，OD值顯著高于其他5個處理組（P＜0.05）。

2.2 APS顯著影響雞脾臟淋巴細(xì)胞因子的分泌

由表3可知，濃度為20 μg/mL的APS處理組中，脾臟淋巴細(xì)胞中分泌的Th1型細(xì)胞因子IL-2、TNF-β、IFN-γ 和 Th2型細(xì)胞因子 IL-4、IL-6 含量與對照組相比，差異均不顯著（P＞0.05）。當(dāng)APS濃度提高至40 μg/mL以上后，4個處理組中IL-2、TNF-β、IFN-γ、IL-4 和 IL-6 的含量均顯著高于對照組（P＜0.05）。IL-2、IFN-γ、IL-4的含量在 APS添加濃度為160 μg/mL時達到最高水平，顯著高于其他處理組（P＜0.05），80 μg/mL的 APS處理組中，這3個細(xì)胞因子的含量也顯著高于40 μg/mL和320μg/mL處理組（P＜0.05）。TNF-β和IL-6的含量在160 μg/mL和320 μg/mL處理組間沒有差異（P＞0.05），但都顯著高于 40 μg/mL 和 80 μg/mL 處理組（P＜0.05），處理濃度為 80 μg/mL時，IL-6的含量顯著高于 40 μg/mL（P＜0.05），但 TNF-β 含量在這兩個處理之間沒有差異（P＞0.05）。

表2 黃芪多糖對雞脾臟淋巴細(xì)胞增殖的影響Table 2 The effect of APS on the proliferation of lymphocyte in spleen of chicken

表3 黃芪多糖對雞脾臟淋巴細(xì)胞因子含量的影響Table 3 The effect of APS on the lymphokines content in splenic lymphocytes of chicken

2.3 APS顯著影響雞脾臟淋巴細(xì)胞因子基因mRNA表達量

由表4可知，濃度為20 μg/mL的APS添加對脾臟淋巴細(xì)胞中IL-2、TNF-β、IFN-γ、IL-4、IL-6基因mRNA表達量影響不顯著（P＞0.05）。APS濃度提高至 40 μg/mL 時，TNF-β、IFN-γ和IL-6基因mRNA顯著高于對照組（P＜0.05）。細(xì)胞中APS濃度大于超過 40 μg/mL，IL-2、TNF-β、IFN-γ、IL-4、IL-6基因mRNA表達量均顯著高于對照組（P＜0.05），其中160 μg/mL效果最佳（P＜0.05）。此外，當(dāng)APS濃度達到 320 μg/mL，IFN-γ、IL-4和IL-6基因 mRNA表達顯著低于80 μg/mL處理組（P＜0.05）。

2.4 APS顯著影響雞脾臟淋巴細(xì)胞表達轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達量

由表5可知，脾臟淋巴細(xì)胞中核轉(zhuǎn)錄因子TBX21和Gata-3的mRNA表達量在APS添加濃度為20 μg/mL時，與對照相比沒有顯著差異（P＞0.05）。APS濃度提高40 μg/mL后，4個處理組中TBX21和Gata-3的mRNA表達量均顯著高于對照組，其中TBX21的mRNA表達量在APS濃度為160 μg/mL的處理組中最高，顯著高于其他處理組（P＜0.05）；Gata-3的mRNA表達量在160 μg/mL和320 μg/mL處理組中沒有差異（P＞0.05），但都顯著高于40 μg/mL和80 μg/mL處理組（P＜0.05）。

3 討論

淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的核心組成，是機體最重要的免疫細(xì)胞，淋巴細(xì)胞的增殖和分化是機體在免疫應(yīng)答過程中最重要的階段，其增殖程度是反映機體細(xì)胞免疫水平的一個重要指標(biāo)[10]。近年來研究表明，APS具有促進淋巴細(xì)胞的增殖與分化，增加胞漿細(xì)胞分泌、提高血清抗體濃度、調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞亞群平衡等作用。王德云等[11]的研究發(fā)現(xiàn)濃度為150 μg/mL的APS協(xié)同ConA刺激雞脾臟淋巴細(xì)胞增殖的效果最好，且具有量效關(guān)系。邱妍[12]采用5個濃度的APS（50、100、200、400 以及 800 μg/mL）對雞脾臟淋巴細(xì)胞進行體外培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，APS可單獨或協(xié)同ConA促進淋巴細(xì)胞增殖，其中以100 μg/mL濃度最佳。章世元等[13]研究證明，一定濃度的APS能顯著促進肉仔雞脾臟和血液中B和T淋巴細(xì)胞增殖，與邱妍的報道一致，也是濃度100 μg/mL時促進效果最明顯。范云鵬等[14]報道，用APS制備的脂質(zhì)體在15.625～125 μg/mL時可單獨或與植物血凝素作用顯著提高雞B和T淋巴細(xì)胞增殖效率。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)APS對雞外周血、胸腺、脾臟和法氏囊中淋巴細(xì)胞增殖效率的影響同樣具有濃度效應(yīng)，160 μg/mL的APS可顯著促進4個組織淋巴細(xì)胞增殖，提示在該濃度下APS可提高細(xì)胞免疫水平。

表 4 黃芪多糖對雞脾臟淋巴細(xì)胞淋巴因子基因mRNA表達量的影響Table 4 The effect of APS on the mRNA expression of lymphokines gene in splenic lymphocytes of chicken

表5 黃芪多糖對雞脾臟淋巴細(xì)胞表達轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達量的影響Table 5 The effect ofAPSonthe mRNA expressionof transcriptionfactor insplenic lymphocytes ofchicken

細(xì)胞因子是由T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞以及NK細(xì)胞等產(chǎn)生的一類具有免疫調(diào)節(jié)功能的蛋白類物質(zhì)，為免疫系統(tǒng)中重要的信息分子[15]。輔助性T細(xì)胞（helper T cell，Th）對機體的特異性和非特異性免疫均具有重要的調(diào)節(jié)作用，既能促進其他T細(xì)胞的分化成熟，又能協(xié)助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，按照其所產(chǎn)生的細(xì)胞因子種類功能，可分為Th1和Th2型細(xì)胞，其中 Th1細(xì)胞主要分泌細(xì)胞因子 IL-2、IFN-γ、TNF-β，介導(dǎo)細(xì)胞免疫，誘導(dǎo)免疫排斥；Th2細(xì)胞主要分泌細(xì)胞因子 IL-4、IL-5、IL-6、IL-10，參與介導(dǎo)體液免疫通過抑制Th1型免疫反應(yīng)從而調(diào)節(jié)免疫耐受性[16]。IL-2由活化的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，可促進Th0和CTL的增殖，也參與抗體反應(yīng)、腫瘤監(jiān)視等，為調(diào)控免疫應(yīng)答的重要因子[17]。TNF-β可增強T細(xì)胞的增殖以及抗原表達，促進IL-2、IFN-γ等淋巴因子的產(chǎn)生，并可增強有絲分裂原或外來抗原對B細(xì)胞的刺激，IFN-γ對B細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的分化有促進作用，增強細(xì)胞免疫功能[18]。IL-4可促使抗原或絲裂原活化的B細(xì)胞分裂增殖，刺激CD4+T細(xì)胞分化成II型輔助T細(xì)胞[19]。IL-6是由T細(xì)胞自身分泌的生長因子，其通過促進B細(xì)胞的存活而間接影響B(tài)細(xì)胞的分化[20]。王俊麗[21]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加100～400 μg/mL的APS可顯著促進肉仔雞淋巴細(xì)胞對IL-2、IL-6以及IFN-γ的分泌，證明APS可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌，促進淋巴細(xì)胞增殖，進而調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能。趙天章等[22]發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加APS可提高肉仔雞血清IL-1、IL-2和TNF-β的含量，以及42齡雞血清IL-2和TNF-β水平。陳洪亮[23]與劉永杰等[24]的試驗同時證明了APS能促進肉仔雞脾臟淋巴細(xì)胞IL-2的分泌，且與APS的添加量相關(guān)。然而，目前關(guān)于APS對雞脾臟淋巴細(xì)胞因子相關(guān)基因表達的影響研究鮮有報道。本試驗結(jié)果顯示，APS對雛雞脾臟淋巴細(xì)胞中Th1細(xì)胞因子IL-2、TNF-β、IFN-γ和Th2型細(xì)胞因子IL-4和IL-6含量的影響同樣呈現(xiàn)劑量效應(yīng)，濃度為160 μg/mL時對細(xì)胞因子的促分泌作用最顯著，在該濃度下，Th1和Th2型5個細(xì)胞因子的mRNA表達量也顯著高于其他處理組，說明APS可能參與雛雞細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)。

輔助性T淋巴細(xì)胞 Th1/Th2細(xì)胞之間的相互平衡在免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用，是機體免疫調(diào)節(jié)的重要系統(tǒng)。由TBX21基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子T-bet是Th1型細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的特異性標(biāo)志，GATA-3是目前確定唯一能調(diào)控Th2型細(xì)胞因子合成的轉(zhuǎn)錄因子[25]。之前的研究已經(jīng)證明TBX21和Gata-3基因表達調(diào)控Th1/Th2細(xì)胞分化，從而影響細(xì)胞因子分泌。本研究結(jié)果顯示，APS添加可以顯著提高TBX21和Gata-3的mRNA表達量，進一步提示APS可以促進雛雞淋巴細(xì)胞分泌Th1和Th2型細(xì)胞因子，且在濃度為160 μg/mL時對這2個基因表達的促進作用最明顯。馬玉芳等[26]和鄭乃珍等[27]分別發(fā)現(xiàn)金線蓮多糖（ARP）和猴頭菇多糖（HEP）能協(xié)同ConA誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄因子T-bet和Gata-3基因表達來上調(diào)小鼠淋巴細(xì)胞Th1、Th2型細(xì)胞因子mRNA表達以及促進細(xì)胞因子分泌，進而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，本研究的結(jié)果與其相似。

4 結(jié)論

APS對雛雞外周血、脾臟、胸腺以及法氏囊中的淋巴細(xì)胞體外增殖均有促進作用，APS還能上調(diào)脾臟淋巴細(xì)胞中Th1和Th2細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet和Gata-3的mRNA表達，從而促進Th1細(xì)胞因子（IL-2、TNF-β和IFN-γ）以及Th2細(xì)胞因子（IL-4和IL-6）分泌，添加濃度為160 μg/mL時效果最為明顯。