郭錦翠，張艷艷，楊振邦，牛澤人，張雪梅

（1.華北理工大學公共衛(wèi)生學院，河北 唐山 063000；2.華北理工大學生命科學學院，河北 唐山 063000）

腫瘤是全人類面臨的一個巨大公共衛(wèi)生問題，肺 癌在所有惡性腫瘤死因中居首位[1]。腫瘤發(fā)生的主要原因之一是腫瘤對補體監(jiān)視的免疫逃避[2]。膜結合性補體調(diào)節(jié)蛋白（membrane-bound complement regulatory proteins, mCRPs）在機體內(nèi)能夠與補體相互作用，動態(tài)調(diào)節(jié)補體的激活與抑制，在保護自身組織的同時還能有效殺滅外來有害成分[3]。CD59作為mCRPs中重要成分之一，與炎癥、創(chuàng)傷及某些腫瘤等疾病有密切的關系[4-5]。研究表明，CD59在乳腺癌[5-6]、結腸癌[7]、肺癌組織[8]中顯現(xiàn)出高表達。

基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism, SNP）是人群中普遍存在的核苷酸改變，而啟動子區(qū)的多態(tài)性影響基因的轉(zhuǎn)錄水平，進一步導致蛋白表達水平的改變，導致腫瘤和疾病的發(fā)生和發(fā)展[9]。本研究旨在探討CD59啟動子區(qū)遺傳變異對基因轉(zhuǎn)錄的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

質(zhì)粒pGL3-Basic、pRL-SV40以及雙熒光素酶報告基因檢測、凝膠回收、質(zhì)粒提取試劑盒購自美國Promega公司，LipofectamineTM2000試劑購自美國Invitrogen公司，限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、NheⅠ和連接酶T4 DNA分別購自美國New England Biolabs和日本TaKaRa公司。A549、NCI-H2030、NCI-H23非小細胞肺癌細胞株購自美國菌種保藏中心。

1.2 實驗方法

1.2.1 啟動子區(qū)SNP篩選 對國際共享數(shù)據(jù)庫Ensembl中基因CD59啟動子區(qū)SNP信息進行數(shù)據(jù)挖掘，將CD59基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游擴展1 500 bp，篩選出可影響基因轉(zhuǎn)錄因子結合位點的SNP位點，規(guī)定在中國人群中的最小等位基因頻率不＞0.05，采用轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫（www.gene-regulation.com）中的軟件TRANSFAC分析軟件預測對轉(zhuǎn)錄因子結合有影響的SNP位點，最終共篩選出1個SNP位點（CD59 rs79077373）。

1.2.2 CD59啟動子區(qū)報告基因載體構建與鑒定 使用Primer Premier 5.0軟件進行引物設計，CD59啟動子區(qū)PCR擴增所用引物序列：正向5'-GGGGTACCCCTC AAGCAACGCAAACTAC-3'，反向5'-CTAGCTAGCTA GCCCCCGCATTCTTTCGCT-3'。該PCR產(chǎn)物長2 282 bp（-2 234 bp，+47 bp）引物兩端分別加上酶切位點KpnⅠ、NheⅠ及對應的保護堿基。

調(diào)整PCR儀器反應程序，將反應體系離心6 s，立即放置到PCR儀，進行片段的擴增，一般在94℃的溫度條件下預變性10 min，然后進入循環(huán)擴增階段：第1階段為94℃變性45 s，第2階段為61.5℃退火45 s，第3階段為72℃延伸2 min，這3個階段進行35個循環(huán)，循環(huán)完成后進行10min的72℃延伸。將擴增片段切膠回收，使用KpnⅠ、NheⅠ進行雙酶切后與pGL3-Basic報告基因載體進行連接。隨后將連接后的產(chǎn)物進一步轉(zhuǎn)化成腸桿菌DH5α，接著挑取其中的陽性單克隆，最后進行測序的確認，構建完成的質(zhì)粒定點突變由蘇州泓迅生物技術有限公司完成，根據(jù)測序結果將重組質(zhì)粒分別標記為pGL3-rs79077373C和pGL3-rs79077373T。

1.2.3 細胞培養(yǎng)及重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1天將狀態(tài)良好的A549、NCI-H23和NCI-H2030以每孔2×105個細胞均勻接種到板中，當密度到70%后，根據(jù)使用說明書轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染情況為：800 ng的重組質(zhì)粒（pGL3-rs79077373C或pGL3-rs79077373T）和10 ng的內(nèi)參質(zhì)粒pRL-SV40，每組轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細胞至少設置3個實驗的復孔，每次以相同的條件相同的試劑至少重復3次實驗。培養(yǎng)24 h后，對細胞進行裂解，然后收集細胞，測定熒光素酶活性。

1.2.4 雙熒光素酶活性檢測 根據(jù)雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒提供的說明書進行操作并設定發(fā)光檢測儀，型號為Glo Max 20/20。600 μl PBS清洗，加100 μl PLB裂解液，室溫下輕搖板15 min，將裂解液移至EP管中，瞬時離心后進行進一步檢測。EP管中加入50 μl LAR Ⅱ和15 μl裂解產(chǎn)物，F(xiàn)值即Firefly熒光素酶活性應被即刻檢測，隨后50 μl 1×Stop &Glo溶液被立即加入到24孔板中，R 值即Renilla熒光素酶活性，計算熒光素酶活性即F值與R值之比。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 生物信息學分析

應用轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫（www.gene-regulation.com）中的軟件TRANSFAC分析預測CD59 rs79077373 C/T遺傳變異對潛在的轉(zhuǎn)錄因子結合位點影響（見圖1）。無轉(zhuǎn)錄因子結合的情況是當該位點為C等位基因時；當該位點出現(xiàn)T等位基因，此時存在轉(zhuǎn)錄因子TBP與之結合。因此采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C預測結果，探討生物學意義。

圖1 生物信息學預測rs79077373 C/T對轉(zhuǎn)錄因子結合位點的影響

2.2 CD59基因啟動子區(qū)重組質(zhì)粒結果驗證

CD59重組質(zhì)粒經(jīng)測序驗證后rs79077373位點為C等位基因，將其命名為pGL3-rs79077373C，利用構建好的重組質(zhì)粒將rs79077373位點進行定點突變，突變后的重組質(zhì)粒命名為pGL3-rs79077373T。重組質(zhì)粒利用雙酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進行驗證，酶切片段與插入片段長度相符（見圖2A）。重組質(zhì)粒測序結果利用Blast與NCBI數(shù)據(jù)庫中CD59基因啟動子區(qū)序列進行比對，一致性為100%（見圖2B）。

圖2 CD59基因啟動子區(qū)載體構建結果驗證

2.3 熒光素酶報告基因活性檢測

將 重 組 質(zhì) 粒 pGL3-rs79077373C、pGL3-rs79077373T、空質(zhì)粒pGL3-Basic分別與內(nèi)參質(zhì)粒pRLSV40共 轉(zhuǎn) 染 于 NCI-H2030、NCI-H23、A549 3株非小細胞肺癌后，熒光素酶活性的表達情況檢測見圖3。重組質(zhì)粒熒光素酶相對活性經(jīng)對照組校正，每組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞至少設置3個復孔，數(shù)據(jù)由3次獨立重復實驗得出，用（±s）表示每組數(shù)值。A549細胞中，pGL3-rs79077373T組的熒光素酶相對活性值為（17.95±0.50），pGL3-rs79077373C組的熒光素酶相對活性值為（8.99±0.56），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=-20.639，P=0.000），pGL3-rs79077373T組的熒光素酶相對活性值為pGL3-rs79077373C組的2.00倍。NCI-H23細胞中，pGL3-rs79077373T組的熒光素酶相對活性值為（18.89±1.13），pGL3-rs79077373C組的熒光素酶相對活性值為（10.36±0.44），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=-12.150，P=0.000），pGL3-rs79077373T 組的熒光素酶相對活性值為pGL3-rs79077373C組的1.82倍。NCIH2030細胞中，pGL3-rs79077373T組的熒光素酶相對活性值為（6.17±0.71），pGL3-rs79077373C組的熒光素酶相對活性值為（4.36±0.43），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=-3.752，P=0.020），pGL3-rs79077373T組的熒光素酶相對活性值為pGL3-rs79077373C組的1.42倍。

圖3 CD59基因rs79077373報告基因熒光素酶相對活性

3 討論

CD59又稱保護素，位于人類11號染色體長臂，其糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定到細胞膜表面。CD59蛋白的功能突出表現(xiàn)在以下幾個方面：①CD59通過與C8和（或）C9結合、干擾C9插入細胞膜內(nèi)或C9的多聚化，進而阻斷補體攻膜復合物（MAC）的裝配，保護宿主細胞免于受補體的溶破[10]。②CD59可以作為第二信號刺激物，一方面可以誘導T淋巴細胞的激活，另外參與免疫反應的調(diào)節(jié)過程[11]。③CD59作為CD2的配體能夠與CD2相結合形成CD59-CD2復合物，隨后激活T細胞并且誘導T細胞及其他組織細胞的黏附，并進一步調(diào)節(jié)組織細胞的生長[12]。

CD59在腫瘤細胞中的高表達可能有助于腫瘤逃避免疫監(jiān)視和補體介導的細胞溶解。CD59在結直腸癌中表達上調(diào)，與結直腸癌的臨床分化和病理分期明顯相關，并且CD59沉默的結腸癌細胞會增強對化療藥物的敏感性[7，13]。在乳腺癌研究中，CD59表達明顯增加并且CD59的缺失可導致腫瘤細胞的凋亡，抑制腫瘤細胞的CD59基因表達后，F(xiàn)as和Caspase-3的表達上調(diào)Bcl-2的表達降低，從而誘發(fā)腫瘤細胞的凋亡和生長抑制[14]。在CD59與肺癌關系的研究中[8，15]，通過體內(nèi)和體外實驗都發(fā)現(xiàn)CD59在腫瘤細胞中的表達要高于正常肺組織細胞，補體系統(tǒng)對腫瘤細胞介導的裂解作用被抑制，CD59的高表達可能是腫瘤細胞逃避補體攻擊和抵制單克隆抗體治療肺癌的重要原因，提示CD59是腫瘤發(fā)生及惡性進展的主要因素之一。

本研究證實，CD59啟動子區(qū)SNP rs79077373 T等位基因可增加CD59的啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄活性，說明CD59啟動子區(qū)遺傳變異可以在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控其表達，為深入研究CD59基因在腫瘤中高表達的分子機制奠定了基礎。