陳小萍 林群華

(1莆田學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部；2莆田市第一醫(yī)學(xué)影像科 福建莆田 351100)

一個(gè)屬于子宮球蛋白超家族的與乳腺癌組織特異相關(guān)的蛋白——人乳腺珠蛋白 (human mammaglobin，hMAM)是近年來專家學(xué)者研究乳腺癌的熱點(diǎn)。乳腺珠蛋白在乳腺組織和乳腺癌組織中表達(dá)具有較高的靈敏度和特異性[1-2],有望成為乳腺癌的特異標(biāo)志蛋白，可為乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)和診斷提供依據(jù)。國內(nèi)外研究者用不同的方法從患者的血清[1]和組織[3]中都檢測(cè)到了這種特異性蛋白。文章利用免疫熒光來檢測(cè)乳腺癌組織中乳腺珠蛋白的表達(dá)情況，探討免疫熒光法檢測(cè)乳腺珠蛋白的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

(1)標(biāo)本。該實(shí)驗(yàn)中的標(biāo)本來自莆田市第一醫(yī)院病理科，其中包括6例乳腺癌、6例正常乳腺(從乳腺纖維瘤旁取材)、6例乳腺纖維瘤。

(2)試劑。該實(shí)驗(yàn)中用的Mamamglobin B polyclonal(貨號(hào)YT2632，購自廈門慧嘉生物生物科技有限公司)，二抗、染料等其他試劑均由上海銳賽生物技術(shù)有限公司提供。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

(1) 固定、切片、脫蠟和水化。取新鮮組織經(jīng)甲醛固定24h后用蠟塊包埋，切成5μm的石蠟帶，在45℃溫水中展片，用干凈的載玻片撈片，在70℃恒溫箱內(nèi)烤片2h后用二甲苯中浸泡10min，更換二甲苯后再浸泡10min,再分別用無水乙醇、95%、70%、50%不同濃度的乙醇和純水中各浸泡5min。

(2) 免疫熒光雙標(biāo)用0.01mol/LPBS 洗5min后滴加3%甲醇-H2O2溶液，靜置15min后再用PBS洗3次，然后進(jìn)行抗原修復(fù)(微波爐中高火力加熱4min后再低火力加熱20min，之后自然降至室溫)。 再用PBS洗5min3次，滴加正常羊血清封閉液，室溫放置60min，甩去多余液體，滴加稀釋度為1∶200的Ⅰ抗100μL，4℃過夜，37℃復(fù)溫45min，PBS再洗10min3次，滴加稀釋度為1∶1000熒光兔Ⅱ抗(加0.05%的Trixton-100)100μL，室溫避光靜置2h。

(3)染色。用PBS洗10min3次，用DAPI避光染色5min，PBS洗5min3次后甘油封片(避光，滴加防淬滅劑)。

(4)顯微鏡觀察。染色的切片用激光共聚焦顯微鏡(德國leica)斷層掃描，圖片疊加。藍(lán)光的發(fā)射波長(zhǎng)為461nm，紅光的發(fā)射波長(zhǎng)568nm，分辨率為553像素×463像素,計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集，以Image J圖像分析軟件對(duì)陽性信號(hào)熒光進(jìn)行蛋白相對(duì)定量計(jì)算分析。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 結(jié)果

免疫熒光發(fā)散光呈紅色， DAPI 光發(fā)散光呈藍(lán)色，DAPI與免疫熒光蛋白的發(fā)散波長(zhǎng)有部分重疊。有熒光蛋白會(huì)發(fā)紅色熒光為陽性，無熒光蛋白的不出現(xiàn)紅色熒光為陰性(見圖1)。乳腺癌組熒光信號(hào)強(qiáng)(見圖1a)，在乳腺纖維瘤和乳腺正常組織中熒光信號(hào)弱(見圖1b和1c)。

圖1 不同乳腺組織中熒光蛋白圖

2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每種研究對(duì)象取4個(gè)不同樣本雙聚焦顯微鏡下隨機(jī)掃描5個(gè)層面，計(jì)算機(jī)計(jì)數(shù)其Area和IOD，取其平均面積和平均積光密度計(jì)算IOD/Area見表1，并以Image J 軟件進(jìn)行圖象分析見圖2。采用SPSS 19.0軟件系統(tǒng)分析，等級(jí)采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。

表1 各樣本組織乳腺珠蛋白表達(dá)的統(tǒng)計(jì)資料

圖2 乳腺珠蛋白相對(duì)表達(dá)量圖

3討論

目前報(bào)道過用于檢測(cè)乳腺珠蛋白的方法有免疫組化法[4]，流式細(xì)胞法，ELISA[2]以及近年來發(fā)展的熒光定量PCR[5-6]。但這些檢測(cè)方法大都存在較高的假陽性，準(zhǔn)確性低，準(zhǔn)確性和靈敏度較高的熒光定量PCR又不能直接體現(xiàn)該蛋白的表達(dá)，所以都存在一定的局限性。免疫熒光法既能直接直觀監(jiān)測(cè)目標(biāo)蛋白的表達(dá)又能提高監(jiān)測(cè)的準(zhǔn)確性和特異性。免疫熒光法與免疫組化的原理大致相同，都是根據(jù)抗原與抗體的特異性結(jié)合后再染色，從染色結(jié)果來觀察多肽、蛋白質(zhì)的定位和相對(duì)定量分析。金晶晶[7]等認(rèn)為免疫組化染色比免疫熒光染色操作步驟繁瑣、耗時(shí)、易出現(xiàn)非特異染色，對(duì)結(jié)果判斷造成一定的干擾。修敏[8]等認(rèn)為免疫熒光法可通過免疫熒光分析軟件更快捷簡(jiǎn)便地處理熒光圖像，實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞熒光參數(shù)的相對(duì)定量分析，對(duì)肉眼難以準(zhǔn)確判斷的熒光圖像具有很好的輔助分析。免疫熒光可以避免免疫組化的短處提高檢測(cè)的特異性和靈敏度，而且免疫熒光的圖像比免疫組化圖像直觀、美觀。

段翠密[4]已報(bào)道過用免疫組化檢測(cè)乳腺癌組織中乳腺珠蛋白的表達(dá)，該研究利用免疫熒光法檢測(cè)乳腺珠蛋白在乳腺癌組織、乳腺纖維瘤組織和正常乳腺組織中的表達(dá)情況。結(jié)果是免疫熒光檢測(cè)乳腺珠蛋白在乳腺癌組織、乳腺纖維瘤組織和乳腺正常組織均有表達(dá) ，乳腺癌與正常組的表達(dá)差異性(p=0.0019，p<0.01 )，乳腺纖維瘤與乳腺正常組的表達(dá)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.071，p>0.05 )不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果與段翠密[4]和呂曉娟[9]的報(bào)道一致。

綜上所述，免疫熒光法檢測(cè)人乳腺珠蛋白克服了其他檢測(cè)方法的局限性，從可行性、靈敏度和特異性方面說明可作為人乳腺珠蛋白的病理檢測(cè)手段。