宋琪玲，何勇均，黃思月，劉青松

1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，四川南充 637000；2.四川賽爾醫(yī)學(xué)檢驗有限公司，四川南充 637131；3.四川省成都市婦女兒童中心醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，四川成都 610032

珠蛋白生成障礙性貧血是目前世界范圍內(nèi)最常見且發(fā)病率較高的遺傳學(xué)溶血性疾病，主要是由珠蛋白基因缺失或突變等原因?qū)е碌闹榈鞍缀铣烧系K的單基因遺傳病。珠蛋白生成障礙性貧血具有明顯的地域性，在我國呈現(xiàn)出南高北低的發(fā)病特點，主要以廣東、廣西、海南、四川等地區(qū)發(fā)病率較高，珠蛋白生成障礙性貧血基因攜帶率為1.92%～14.96%[1]。四川地域廣闊，地形多樣，兼具平原和丘陵，民族多樣。近年來，有研究報道四川地區(qū)珠蛋白生成障礙性貧血發(fā)病率呈上升趨勢[2]，但目前對川東北地區(qū)，包括南充、遂寧等，較大數(shù)據(jù)的珠蛋白生成障礙性貧血基因結(jié)果分析較少，為更加準(zhǔn)確地了解南充及遂寧等地區(qū)珠蛋白生成障礙性貧血的發(fā)病特點，準(zhǔn)確預(yù)防和診斷本地區(qū)珠蛋白生成障礙性貧血，減少出生缺陷，本研究對川東北地區(qū)16 249例珠蛋白生成障礙性貧血患者進(jìn)行篩查并分析其基因型，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2019年12月在川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院及四川賽爾醫(yī)學(xué)檢驗有限公司接受珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測的患者共16 249例。其中男1 845例，女14 404例，年齡0個月至63歲。本研究經(jīng)川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會審查通過。

1.2方法

1.2.1DNA分離提取 采用乙二胺四乙酸二鉀無菌真空抗凝管采集研究對象外周血標(biāo)本2 mL，采用全自動DNA提取儀磁珠法提取DNA，所用儀器和試劑購自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司。

1.2.2PCR擴增 將α、β-珠蛋白生成障礙性貧血PCR mix與Taq酶按要求混勻后，取45 μL分裝到0.2 mL PCR管中；向已分裝反應(yīng)液的PCR管中加入5 μL DNA 模板，瞬時離心后，上機擴增。

1.2.3擴增產(chǎn)物的導(dǎo)流雜交 嚴(yán)格按照雜交試劑盒說明書(購自廣東凱普生物科技股份有限公司)進(jìn)行檢測。

1.2.4結(jié)果判斷 根據(jù)試劑盒提供的珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測結(jié)果分析圖比較分析判斷結(jié)果。

1.2.5室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)控 室內(nèi)質(zhì)控:雜交膜條上有3個α和6個β正常對照點，每次試驗所有正常對照點均應(yīng)顯色，突變純合子及缺失純合子除外，否則需重新提取DNA、PCR擴增、雜交。同時，為排除試驗過程出現(xiàn)污染，防止假陽性結(jié)果出現(xiàn)，使用蒸餾水作陰性質(zhì)控，全程參與提取、擴增、雜交，陰性質(zhì)控結(jié)果無任何雜交顯色點，視為試驗過程無污染。此外，將已知珠蛋白生成障礙性貧血型別的陽性標(biāo)本按照檢測標(biāo)本量分裝保存于-70 ℃，試驗時已知珠蛋白生成障礙性貧血型別的陽性標(biāo)本與檢測標(biāo)本同步處理，全程參與提取、擴增、雜交，得到已知相同的珠蛋白生成障礙性貧血型別，視為該批珠蛋白生成障礙性貧血結(jié)果在控、可靠。室間質(zhì)控：實驗室每年均參加了中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會組織的2次珠蛋白生成障礙性貧血基因分型檢測的室間質(zhì)控，成績均為100% 。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 使用 Excel2016建立數(shù)據(jù)庫，采SPSS22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，計數(shù)資料以例數(shù)和百分率表示。

2 結(jié) 果

2.1α-珠蛋白生成障礙性貧血患者的基因型和構(gòu)成比 16 249例患者中共檢出2 467例珠蛋白生成障礙性貧血患者，在2 467例珠蛋白生成障礙性貧血患者中α-珠蛋白生成障礙性貧血1 318例，構(gòu)成比為53.43%(1 318/2 467)，包含13種亞型。其中，靜止型α-珠蛋白生成障礙性貧血以αα/αα3.7為主，占37.10%(489/1 318)；標(biāo)準(zhǔn)型α-珠蛋白生成障礙性貧血以--SEA/αα為主，占50.53%(666/1 318)；血紅蛋白H病以--SEA/αα3.7為主，占2.43%(32/1 318)。α-珠蛋白生成障礙性貧血的基因診斷結(jié)果及臨床分型的詳細(xì)情況見表1。

表1 α-珠蛋白生成障礙性貧血患者基因型和構(gòu)成比

2.2β-珠蛋白生成障礙性貧血患者基因型和構(gòu)成比 在2 467例珠蛋白生成障礙性貧血患者中β-珠蛋白生成障礙性貧血1 086例，構(gòu)成比為44.02%(1 086/2 467)，但全為輕型β-珠蛋白生成障礙性貧血。共檢出11種突變基因型，包括CD17(A→T)、CD41/42(TCTT)、IVSII654(C→T)、NT-28(A→G)、29(A→G)、CD43(G→T)、CD14-15(+G)、CD71-72(+A)CD27-28(+C)、βE3(G→A)、CAP(A→C或-AAAC)。其中，輕型β-珠蛋白生成障礙性貧血以β17/βN為主，占37.20%(347/1 086)；其次為β41-42/βN，占29.28%(318/1 086)；β-珠蛋白生成障礙性貧血的基因診斷結(jié)果及臨床分型的詳細(xì)情況見表2。

表2 β-珠蛋白生成障礙性貧血患者基因型和構(gòu)成比

2.3α合并β-珠蛋白生成障礙性貧血基因型和構(gòu)成比 在2 467例珠蛋白生成障礙性貧血患者中α合并β-珠蛋白生成障礙性貧血共63例，構(gòu)成比為2.55%(63/2 467)，包含9種亞型。其中以--SEA/β41-42占比最高，占33.33%(21/63)；其次為αα3.7/β17，占15.87%(10/63)；α合并β-珠蛋白生成障礙性貧血的基因診斷結(jié)果及臨床分型的詳細(xì)情況見表3。

表3 α合并β-珠蛋白生成障礙性貧血基因型和構(gòu)成比

3 討 論

本研究基因診斷陽性率為15.18%(2 467/16 249)，明顯高于已報道的四川地區(qū)珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測平均陽性率[1]。本次研究樣本較大，基本覆蓋南充地區(qū)，遂寧地區(qū)部分覆蓋，且均采用基因檢測進(jìn)行診斷，更能準(zhǔn)確反映川東北地區(qū)人員珠蛋白生成障礙性貧血基因攜帶情況。在2 467例基因診斷陽性患者中，α-珠蛋白生成障礙性貧血有1 318例，占53.43%(1 318/2 467)；β-珠蛋白生成障礙性貧血有1 086例，占44.02 %(1 086/2 467)；α合并β-珠蛋白生成障礙性貧血63例，占2.55%(63/2 467)?？傮w依然是以α-珠蛋白生成障礙性貧血為主，與其他研究一致[2-4]。

在1 318例α-珠蛋白生成障礙性貧血中，最常見的是SEA雜合缺失，共666例，占50.53%(666/1 318)；其次是3.7位點雜合缺失，共489例，占37.10%(489/1 318)。本研究中α-珠蛋白生成障礙性貧血以--SEA/αα、αα/αα3.7為主，該結(jié)果與部分研究報道的α-珠蛋白生成障礙性貧血基因常見基因型一致[3-6]。當(dāng)SEA雜合缺失患者進(jìn)行婚配時，對其配偶進(jìn)行珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測，可預(yù)防血紅蛋白H病患兒及重型珠蛋白生成障礙性貧血患兒的出生。本研究共檢出血紅蛋白H病65例，占4.93%(65/1 318)。血紅蛋白H病的臨床表現(xiàn)個體化差異較大，及早的采用珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測確診有利于疾病治療，尤其是兒童患者的血紅蛋白H病[7]。

1 086例β-珠蛋白生成障礙性貧血中最常見的是17位點雜合突變，共347例，占31.95%(347/1 086)；其次是41～41位點雜合突變，共318例，占29.28%(318/1 086)。與研究報道的珠蛋白生成障礙性貧血基因型分布基本一致[7-8]。本研究中1 086例患者全為輕型β-珠蛋白生成障礙性貧血，原因一方面是樣本數(shù)有限，另一方面中間型和重型β-珠蛋白生成障礙性貧血臨床表現(xiàn)較重，大部分可能已經(jīng)前往其他醫(yī)院進(jìn)行治療，無法收集資料。中間型β-珠蛋白生成障礙性貧血臨床表現(xiàn)差異大，且很難根據(jù)其基因型預(yù)測臨床表現(xiàn)；重型β-珠蛋白生成障礙性貧血患兒多在出生后數(shù)月患病，目前尚無理想的治療方法[9]。

在2 467例珠蛋白生成障礙性貧血患者中α合并β-珠蛋白生成障礙性貧血共63例，構(gòu)成比為2.55%(63/2 467)，包含9種亞型。α合并β-珠蛋白生成障礙性貧血又稱復(fù)合型珠蛋白生成障礙性貧血，與其他疾病不同，是由α-珠蛋白和β-珠蛋白同時發(fā)生生成障礙，反而一定程度上緩解了α/β鏈的不平衡，使血紅蛋白組成趨于正常，臨床表現(xiàn)也相對較輕[10]。盡管α合并β-珠蛋白生成障礙性貧血患者在臨床表現(xiàn)上不一定比單純α-珠蛋白生成障礙性貧血或β-珠蛋白生成障礙性貧血嚴(yán)重，但遺傳給下一代的概率更高[11]。

綜上所述，川東北地區(qū)珠蛋白生成障礙性貧血基因陽性率高于四川平均水平。α-珠蛋白生成障礙性貧血患者較β-珠蛋白生成障礙性貧血患者多見，α-珠蛋白生成障礙性貧血主要基因型為--SEA/αα、αα/αα3.7；β-珠蛋白生成障礙性貧血主要基因型為β17/βN、β41-42/βN。在四川東北部地區(qū)廣泛開展珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測，有助于預(yù)防珠蛋白生成障礙性貧血患兒的出生。