方道贈，王 寧，張 亮，李 娜，隋玉杰

0 引言

環(huán)境激素，又稱內(nèi)分泌干擾物，是指一類外源性化合物，具有類似雌性激素的作用，可通過干擾生物體內(nèi)天然激素的產(chǎn)生、代謝或排出而影響正常的激素功能，從而造成內(nèi)分泌、生殖系統(tǒng)紊亂或病變[1-2]。環(huán)境激素種類眾多，包括人工合成激素、農(nóng)藥類、鄰苯二甲酸酯類、金屬化合物類等[3]。其中，鄰苯二甲酸酯類化合物因在塑料制品、化妝品、涂料、農(nóng)藥等行業(yè)具有廣泛的需求，因此每年的產(chǎn)量也相當(dāng)驚人，有幾百萬噸之多。而因其不會與基質(zhì)之間形成共價鍵，極易從基質(zhì)中釋放出來，對大氣、土壤、水環(huán)境造成污染[4]。在進入水環(huán)境后，由于其較高的脂溶性，極易被水中生物吸收，且具有蓄積性，最終通過水產(chǎn)品進入人體，長期累積將對人體造成危害。因鄰苯二甲酸酯類化合物的污染和危害性，已被國內(nèi)外列為優(yōu)先控制污染物。

目前，我國水產(chǎn)品中鄰苯二甲酸酯類環(huán)境激素的檢測研究工作還在起步階段，且檢測方法研究主要集中在氣相色譜法[5-6]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[7-8]、高效液相色譜法[9]等。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法利用保留時間與特征離子對動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測相結(jié)合，可大大降低多種待測物同時檢測時的相互干擾，且靈敏度明顯優(yōu)于以上3種方法，彌補了以上3種方法易出現(xiàn)假陽性、檢出限高等問題，是今后水產(chǎn)品中鄰苯二甲酸酯類環(huán)境激素檢測方法的趨勢所向。

研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，結(jié)合固相萃取前處理技術(shù)，對水產(chǎn)品中22種鄰苯二甲酸酯類環(huán)境激素：鄰苯二甲酸單甲酯（MMP）、鄰苯二甲酸單丁酯（MBP）、鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）、鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）、鄰苯二甲酸二異丙酯（DIPP）、鄰苯二甲酸二丙酯（DPRP）、鄰苯二甲酸二苯酯（DPHP）、鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）、鄰苯二甲酸二異丁酯（DIBP）、鄰苯二甲酸芐基丁基酯（BBP）、鄰苯二甲酸二環(huán)己酯（DCHP）、鄰苯二甲酸二己酯（DHXP）、鄰苯二甲酸二庚酯（DHP）、鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）、鄰苯二甲酸二辛酯（DOP）、鄰苯二甲酸二異辛酯（DIOP）、鄰苯二甲酸二（2-甲氧基） 乙酯（DMEP）、鄰苯二甲酸二（4-甲基-2-戊基酯） （BMPP）、鄰苯二甲酸二（2-乙氧基） 乙酯（DEEP）、鄰苯二甲酸二戊酯（DPP）、鄰苯二甲酸二 （2-丁氧基） 乙酯（DBEP）、鄰苯二甲酸二異壬酯（DINP） 開展檢測技術(shù)研究。

1 試驗材料與方法

1.1 儀器與試劑

1290/6470型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國Agilent公司產(chǎn)品；KQ-500DB型超聲波發(fā)生器，昆山舒美超聲儀器有限公司產(chǎn)品；24位固相萃取裝置、500 mg/6 mL Si/PSA SPE玻璃固相萃取柱、EFAA-DC24-RT型氮吹儀，上海安譜實驗科技股份有限公司產(chǎn)品；Research Plus型微量移液器，美國Eppendorf公司產(chǎn)品；超純水處理系統(tǒng)，美國Millipore公司產(chǎn)品。

MMP（98.0%），DMP（99.6%），DMEP（98.0%），MBP（98.0%），DEP（99.1%），DEEP（99.5%），DIPP（99.0%），DPRP（98.0%），DPHP（99.8%），DIBP（99.5%），BBP（98.5%），DBP（99.4%），DBEP（99.0%），DPP（99.2%），DCHP（98.7%），BMPP（99.0%），DHXP（98.0%），DHP（99.0%），DIOP（99.4%），DEHP（99.3%），DOP（99.3%），DINP（99.0%） 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，購于德國Dr.Ehrenstorfer公司；乙酸乙酯、正己烷、甲醇、甲酸均為色譜純，購上海安譜實驗科技股份有限公司；乙酸銨、色譜純，購于美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

稱取22種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適量于容量瓶中，用甲醇溶解并定容，分別配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的單標(biāo)儲備液。取22種儲備液各1 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇定容，制得10 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，以上溶液均于-20℃下保存。臨用時，取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液適量，用空白樣品前處理所得基質(zhì)溶液配制成質(zhì)量濃度為 10，50，100，200，1 000 μg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 試驗方法

1.3.1 前處理條件

準(zhǔn)確稱取5 g剪碎的魚肉樣品于100 mL錐形瓶中，加入20 mL乙酸乙酯、5 g無水硫酸鈉，用均質(zhì)器均質(zhì)1 min，靜置30 min后移取上清液至50 mL刻度玻璃試管中，殘渣中再加入20 mL乙酸乙酯，超聲10 min后過濾，合并移至50 mL刻度玻璃試管中，用乙酸乙酯定容至50 mL。移取10 mL提取液至玻璃離心管中，于50℃下氮吹至近干，再用5 mL正己烷溶解，旋渦均勻，待SPE凈化。

將Si/PSA SPE玻璃萃取小柱裝至固相萃取裝置上，用5 mL正己烷活化，棄去流出液，將待凈化液加入萃取小柱中，用4 mL正己烷分2次洗滌離心管并過柱，再用4 mL正己烷淋洗小柱，待小柱抽干后用5 mL乙酸乙酯洗脫，洗脫液收集后經(jīng)50℃氮吹至近干，甲醇定容至5 mL，經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾至進樣瓶，待儀器進樣分析。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），流速0.2 mL/min，柱溫35℃，進樣量5 μL，流動相A為甲醇（含0.1%甲酸和5 mmol/L乙酸銨），流動相B為水（含0.1%甲酸和5 mmol/L乙酸銨）。

梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.3.3 質(zhì)譜條件

電離方式ESI+；毛細管電壓3 500 V；干燥氣溫度325℃；干燥氣流速11 L/min；霧化器壓力45 psi；監(jiān)測模式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。

22種鄰苯二甲酸酯類環(huán)境激素的多反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜圖

22種鄰苯二甲酸酯類環(huán)境激素的色譜見圖1。

表2 22種鄰苯二甲酸酯類環(huán)境激素的多反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)

試驗表明，在流動相中加入甲酸可促進化合物的離子化，乙酸銨的加入可有效改善目標(biāo)化合物的峰形，提高檢測靈敏度和穩(wěn)定性；通過調(diào)節(jié)流動相梯度洗脫程序，使22種目標(biāo)化合物在27 min內(nèi)得到良好的分離。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

空白魚肉樣品經(jīng)前處理所得樣液作為基質(zhì)，配制質(zhì)量濃度分別為 10，50，100，200，1 000 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，用優(yōu)化的儀器方法進行分析，所得色譜圖的峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

22種鄰苯二甲酸酯類環(huán)境激素的線性方程、相關(guān)系數(shù)、平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表3。

從表中的結(jié)果可以看出，22種目標(biāo)化合物在10～1 000 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的線性相關(guān)系數(shù)R2均不低于0.996 8，線性關(guān)系良好。

2.3 方法的檢出限

空白魚肉樣品加標(biāo)10 μg/kg，按照試驗方法進行前處理和儀器分析后，對所得圖譜進行信噪比分析，發(fā)現(xiàn)22種鄰苯二甲酸酯類環(huán)境激素的信噪比均大于3，因此22種環(huán)境激素的檢出限均低于10 μg/kg。

圖1 22種鄰苯二甲酸酯類環(huán)境激素的色譜

2.4 方法的回收率和精密度

在空白魚肉樣品中添加50，100 μg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照試驗方法進行前處理和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀器分析，6次獨立重復(fù)試驗所得平均回收率和精密度。由表3可知，22種環(huán)境激素的平均回收率在83.5%～103.1%，RSD均低于9%，表明該方法準(zhǔn)確度較高、精密度良好。

3 結(jié)論

利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法實現(xiàn)了對水產(chǎn)品中22種鄰苯二甲酸酯類環(huán)境激素的測定。利用該試驗方法可使22種目標(biāo)化合物得到有效分離，在10～1 000 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，回收率為83.5%～103.1%，RSD為2.1%～8.2%，檢出限均低于10 μg/kg。該方法可為水產(chǎn)品中環(huán)境激素風(fēng)險的監(jiān)控提供技術(shù)支持，也可為相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定奠定基礎(chǔ)。

表3 22種鄰苯二甲酸酯類環(huán)境激素的線性方程、相關(guān)系數(shù)、平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差