鄧雅妮，郭時印，肖 航，唐忠海

果蔬中富含活躍而具有保健作用的植物化學(xué)物質(zhì)，多酚是其中主要的具有功能活性的一種次生代謝產(chǎn)物，分子結(jié)構(gòu)中有若干酚性羥基，在大多數(shù)植物性食物中的幾乎所有器官中都很常見[1]。根據(jù)多酚的結(jié)合方式和萃取方法的不同，分為可萃取多酚（Extractable polyphenol，簡稱EP） 和不可萃取多酚（Non-extractable polyphenol，簡稱 NEP）[2-4]。NEP 的測定不能用單純的溶劑提取，需要通過化學(xué)或酶處理萃取物的殘渣以打破多酚物質(zhì)與細(xì)胞壁結(jié)合的化學(xué)鍵，才能將其分離出來[2-3]。大多數(shù)文獻(xiàn)中的多酚僅局限于EP，然而據(jù)已有研究表明，不可萃取多酚的含量在多種植物資源中遠(yuǎn)高于可萃取多酚，且不可萃取多酚在人體腸道中能產(chǎn)生可被吸收的代謝產(chǎn)物，表現(xiàn)出較可萃取多酚更強(qiáng)的抗氧化作用，以及在胃腸道方面的生理作用。綜述了果蔬中不可萃取多酚（NEP）的研究進(jìn)展，重點是不可萃取多酚的提取、測定、生物可利用性及與健康相關(guān)的特性，以期為果蔬中不可萃取多酚在食品中進(jìn)一步的研究和生物活性方面的應(yīng)用提供參考和思路。

可萃取多酚和不可萃取多酚見圖1[5]。

1 果蔬中的不可萃取多酚

圖1 可萃取多酚和不可萃取多酚

EP是指通過簡單的水或有機(jī)溶劑萃取就可獲得的由低分子量化合物組成的混合物，包括可萃取原花青素（EPA）、一部分水合單寧酸（HT），以及其他黃酮類、酚酸等。NEP也被稱為高分子抗氧化劑，主要是指結(jié)合于細(xì)胞壁上的一些不可萃取原花青素（Non-extrable proanthocyanidins，簡稱 NEPA） 和可水解多酚（Hydrolysable polyphenols，簡稱HP），約占總多酚的57%[3]。在上個世紀(jì)70年代，不可萃取原花青素在豆科植物中被發(fā)現(xiàn)，但由于當(dāng)時缺乏先進(jìn)的分析和檢測手段而未受到重視，直至上世紀(jì)90年代國外科學(xué)家才開始對植物性食物中的不可萃取多酚進(jìn)行深入研究，2007年Fulgencio Saura Calixto帶領(lǐng)的團(tuán)隊研究了傳統(tǒng)西班牙飲食中果蔬、豆類、谷類等食物中的NEP[4]。2009年Sara Arranz提出植物性食物中NEP的含量被遠(yuǎn)遠(yuǎn)低估了[2]。近年來，國內(nèi)學(xué)者如程安瑋[6]、韓彩靜[7]、閻海青[8]等人開始關(guān)注并研究果蔬中的NEP，研究較多的是藍(lán)莓果實及葉、洋蔥、火棘等膳食多酚含量豐富的果蔬。

2 不可萃取多酚的提取

對不可萃取多酚的提取，其中原料的處理包括新鮮、凍干或烘干呈粉末狀的[9]。用有機(jī)溶劑萃取時一般選擇甲醇、乙醇，除此之外丙酮、乙酸乙酯等也常被應(yīng)用。

2.1 酸水解法

2007年西班牙學(xué)者Fulgencio Saura Calixto等人提出用酸法提取不可萃取多酚，先使用甲醇和丙酮萃取樣品中的可萃取多酚，留濾渣備用。然后，使用5 ml/L的HCl-丁醇溶液，于100℃條件下提取3 h，萃取出殘渣中的不可萃取原花青素（NEPA）。利用分光光度計，于波長550 nm處測定吸光度，根據(jù)在相同條件下處理得到的角豆莢的單寧含量繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出NEPA的含量。同時用甲醇-硫酸（90∶10）溶液，于85℃條件下提取20 h處理得到可水解多酚（HPP），可水解多酚主要是由可水解單寧、酚酸、羥基肉桂酸組成，在強(qiáng)酸的作用下便從殘渣中萃取出來。將過濾后的水解產(chǎn)物注射到反向色譜中的C18柱中，通過色譜法進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，果蔬中不可萃取多酚（包括NEPA和HTT） 的含量遠(yuǎn)高于可萃取多酚，水果中不可萃取多酚和可萃取多酚含量分別約為 19.3±3.58 mg/（g·DW），5.38±0.20 mg/（g·DW），蔬菜中不可萃取多酚和可萃取多酚含量分別約為 4.56±0.33 mg/（g·DW），0.86±0.13 mg/（g·DW），其中不可萃取原花青素沒有在蔬菜中檢測出來[4]。2009年西班牙學(xué)者Sara Arranz也用類似方法提取不可萃取多酚，結(jié)果顯示不可萃取多酚的含量是可萃取多酚的5倍多[2]。程安瑋等人[6]用酸性提取方法對藍(lán)莓中NEP進(jìn)行了研究，測定到藍(lán)莓中NEPP的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于EP的含量，甚至超過7倍，最高的含量達(dá)到23.63±1.22 mg/（g·DW）。

2.2 堿水解法

除了應(yīng)用較多的酸水解法處理外，不可萃取多酚還能用堿法提取，2013年閻海清等人[8]采用堿法提取藍(lán)莓中的不可萃取多酚，樣品經(jīng)過乙醇處理，再經(jīng)超聲、離心等操作后，收集沉淀，烘干、粉碎，將NaOH溶液加入離心管進(jìn)行超聲處理，然后離心、過濾，收集萃取液，即得到不可萃取多酚溶液。程安瑋等人[6]通過比較發(fā)現(xiàn)，堿水解法處理得到的NEP的含量遠(yuǎn)比酸水解法多，最大值可達(dá)到54.96 mg/（g·DW）[10]。

2.3 其他方法

隨著分析檢測技術(shù)的進(jìn)步，人們開始使用更先進(jìn)的方法，如酶法提取、超聲或微波輔助萃取、減壓萃取法提取植物性食物中的多酚。若要想得到純度較高的不可萃取多酚溶液，就需要對粗萃取液進(jìn)行分離純化。國內(nèi)學(xué)者程安瑋等人[6]2010年采用超聲輔助酸水解的方法萃取藍(lán)莓中不可萃取多酚，2014年閻海青等人[8]采用超聲輔助NaOH堿水解的方法對不可萃取藍(lán)莓多酚的萃取工藝進(jìn)行研究，并利用大孔樹脂動態(tài)吸附、乙酸乙酯層析獲得純度較高的不可萃取多酚溶液，再利用高效液相色譜法分析其組分，發(fā)現(xiàn)不可萃取多酚的組成主要是燕草色素類、飛燕草色素類、牽?；ㄉ仡?、矢車菊色素類、芍藥花色素、錦葵色素類和乙?；幕ㄉ?，與可萃取多酚大致相似[11]。韓彩靜等人[7]研究采用大孔樹脂HPD-IOOC進(jìn)NEP的動態(tài)純化，得到相同的結(jié)論。

3 不可萃取多酚的代謝和生物可利用性

果蔬中的不可萃取多酚被人體攝入后，不能在口腔、胃、小腸中從食品基質(zhì)中被釋放，而是保持完整地到達(dá)結(jié)腸，被結(jié)腸內(nèi)微生物群發(fā)酵，糖苷鍵斷裂形成苷元或進(jìn)一步發(fā)生環(huán)裂解，產(chǎn)生具有生物活性的代謝產(chǎn)物，從而被人體吸收利用或排泄[12]，這些代謝產(chǎn)物能在人體的尿液或糞便中檢測出來[13]。NEP在結(jié)腸中的釋放機(jī)制主要有2種，一是與糖、有機(jī)酸、脂類等酯化的酚類在結(jié)腸菌群產(chǎn)生的酯酶作用下斷裂酯鍵。二是鞣花單寧等聚合物則需微生物裂解其共軛基團(tuán)[14]。一些學(xué)者指出不可萃取原花青素在結(jié)腸內(nèi)被分解成苯乙酸、苯丙酸、苯丁酸或其羥基化合物，酚酸經(jīng)腸道直接吸收或與腸道細(xì)胞表面特定或非特定受體結(jié)合，通過影響多個基因的表達(dá)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮生理功能[15-16]。水解單寧等聚合物則在腸道微生物（如大腸桿菌、雙歧桿菌、乳桿菌、桿菌、真桿菌等）的作用下了進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化[17]。也有學(xué)者提出鞣花單寧在微生物群的作用下水解成鞣花酸、尿石素等，能在血液中檢測出來[18]。Kubow S等人[19]研究發(fā)現(xiàn)，紫肉甘薯中花色素苷降解和生物有效性依賴于結(jié)腸微生物的分解。Padayachee A等人[20]研究發(fā)現(xiàn)果蔬中與胞壁結(jié)合的多酚在結(jié)腸中通過細(xì)胞壁降解菌作用而被釋放。P??Rez-Jim??Nez J等人[13]指出NEP的代謝產(chǎn)物在人體內(nèi)的循環(huán)時間比EP長，使得NEP部分的食品基質(zhì)能夠在結(jié)腸內(nèi)發(fā)酵得更久。

關(guān)于不可萃取多酚的生物活性在上個世紀(jì)就通過體外試管試驗和動物試驗證實了[21]，試驗顯示NEP不受腸道內(nèi)消化液的干擾，必須經(jīng)過腸道酶或微生物菌群水解，釋放酚苷元才能被吸收，結(jié)腸內(nèi)的微生物發(fā)揮了非常重要的作用。在吸收過程中，膳食多酚先后在腸和肝臟中代謝，主要包括甲基化、硫酸化、葡萄糖醛酸化。吸收后一部分多酚進(jìn)入血液循環(huán)，一部分被外排回腸腔。酚類化合物的母核結(jié)構(gòu)以及羥基的數(shù)目和位置影響它們與代謝酶、藥物轉(zhuǎn)運載體的親和力，在胃腸道體現(xiàn)不同的吸收特性，最終影響膳食多酚的生理效應(yīng)和功能活性。其他成分的存在，如多糖和蛋白質(zhì)，可能會影響NEP的發(fā)酵效率，有研究顯示，膳食纖維的存在可以促進(jìn)不可萃取多酚的結(jié)腸發(fā)酵[22]。

4 不可萃取多酚的生物活性

早在2000年，就有學(xué)者結(jié)合體外試管試驗[23-24]、細(xì)胞培養(yǎng)[25]、動物試驗[26]、人體試驗[27]來研究NEP與健康相關(guān)的特性。許多研究顯示，NEP在腸胃道健康方面發(fā)揮了重要作用，主要通過以下幾個機(jī)制的綜合作用：一是NEP能增強(qiáng)促進(jìn)結(jié)腸內(nèi)容物抗氧化能力和內(nèi)源性抗氧化劑的表達(dá)，從而抵抗存在于結(jié)腸內(nèi)的促腫瘤活性氧簇 （ROS）[12，13，28-29]。許盈芄等人[30]對火棘中不可萃取多酚的研究表示，ABTS及FRAP抗氧化能力均與NEPP含量呈良好正相關(guān)。二是促進(jìn)腸道益生菌的增殖，減少有害菌的比例[31]。三是上皮組織誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡以及隱窩數(shù)量和尺寸的減小，促進(jìn)了抗增殖能力[29]。四是對腸道癌癥的抑制作用[32]。五是對基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用[33]。除此之外，在結(jié)腸內(nèi)產(chǎn)生的這些代謝產(chǎn)物還能預(yù)防腦血管疾?。–VD） 的發(fā)生，降低血壓、血糖和血漿膽固醇[33-34]，NEP對慢性疾病的影響成為當(dāng)今的研究熱點。

5 結(jié)語

不可萃取多酚主要由不可萃取原花青素和可水解多酚組成，雖然果蔬中不可萃取多酚的研究遠(yuǎn)少于可萃取多酚，但已有研究顯示不可萃取多酚的含量遠(yuǎn)高于可萃取多酚。不可萃取多酚在結(jié)腸中的代謝和生物可利用度，與腸道健康方面有緊密聯(lián)系，對慢性疾病能起到預(yù)防和治療的作用，也因此果蔬中不可萃取多酚潛藏的價值成已為討論的熱點。但是其在人體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化途徑的相關(guān)數(shù)據(jù)尚不夠明確，生物可利用度也不高，有待進(jìn)一步的研究。