徐云強(qiáng),孫衛(wèi)青,熊光權(quán),李新,丁安子,石柳,汪蘭*
(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所,武漢 430064;2.長(zhǎng)江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,湖北 荊州 434023)
魚(yú)露又叫魚(yú)醬油,主要是用低價(jià)值的海魚(yú)、海蝦以及它們加工的下腳料為原材料,與一定比例的食鹽混合,利用原料自身的內(nèi)源酶和多種微生物之間的共同作用,對(duì)原料中的蛋白質(zhì)、脂肪等營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行發(fā)酵分解,釀造而成[1,2]。其味道鮮美、香氣濃郁、營(yíng)養(yǎng)豐富,富含人體所必需的氨基酸和?;撬?,還含有多種有機(jī)酸和微量元素[3],深受各國(guó)人民的喜愛(ài)。水產(chǎn)調(diào)味品具有鮮美的風(fēng)味和口感,具有極大的開(kāi)發(fā)價(jià)值,目前對(duì)水產(chǎn)調(diào)味品的研究多以海產(chǎn)品為主[4]。
鯽魚(yú)(Carassiusauratus)屬于鯉科,鯉亞科,鯽屬,在淡水魚(yú)類(lèi)中屬于食用價(jià)值較高的魚(yú)類(lèi)。鯽魚(yú)不僅營(yíng)養(yǎng)豐富,還具有顯著的保健功能。鯽魚(yú)所含的蛋白質(zhì)品質(zhì)優(yōu)良,易被消化吸收,是心腦血管疾病患者的良好蛋白質(zhì)來(lái)源,常食用對(duì)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)、增強(qiáng)抵抗力有顯著功效[5]。據(jù)2010年《中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》顯示,我國(guó)淡水養(yǎng)殖總產(chǎn)量為2216.46萬(wàn)噸,魚(yú)類(lèi)總產(chǎn)量為1957.27萬(wàn)噸,其中鯽魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)量為205.55萬(wàn)噸,占我國(guó)淡水養(yǎng)殖總產(chǎn)量的10%左右[6]。因鯽魚(yú)魚(yú)肉肌間刺多,食用不方便,導(dǎo)致其經(jīng)濟(jì)價(jià)值較低[7]。傳統(tǒng)加工方法主要是生產(chǎn)罐頭等,但由于產(chǎn)品附加值較低,因而采用現(xiàn)代生物技術(shù)來(lái)更好地開(kāi)發(fā)鯽魚(yú)資源,提高其附加值。
在鯽魚(yú)產(chǎn)品的生產(chǎn)加工過(guò)程中,會(huì)產(chǎn)生大量包括魚(yú)頭、魚(yú)皮、魚(yú)鰭、魚(yú)尾、魚(yú)骨及少量殘留魚(yú)肉在內(nèi)的加工副產(chǎn)品,而且其重量約占原料魚(yú)總重的40%~50%[8]。由于缺少對(duì)下腳料有效的加工方法,使得下腳料直接當(dāng)作廢棄物丟掉,隨著鯽魚(yú)淡水養(yǎng)殖業(yè)和加工業(yè)的發(fā)展,鯽魚(yú)加工副產(chǎn)品的數(shù)量將越來(lái)越多,這不僅會(huì)導(dǎo)致資源的浪費(fèi),而且還會(huì)造成海洋,陸地環(huán)境的嚴(yán)重污染[9]。因此,該問(wèn)題引起國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注,各國(guó)都積極地進(jìn)行鯽魚(yú)加工副產(chǎn)物綜合利用方面的研究。
本研究通過(guò)去鱗、去鰓、去內(nèi)臟的鯽魚(yú)整魚(yú)為原料,經(jīng)骨泥磨粉碎后加水制成鯽魚(yú)基料,在基料中接種米曲霉和魯氏酵母進(jìn)行發(fā)酵,研究發(fā)酵過(guò)程中各種氨基酸的變化,希望獲得更好口味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的低鹽魚(yú)露的快速發(fā)酵技術(shù)。
新鮮鯽魚(yú):購(gòu)于武商量販農(nóng)科城店;米曲霉GIM3.453、魯氏酵母A180s:購(gòu)于廣東省微生物菌種保藏中心。
麩皮、豆粕:購(gòu)于農(nóng)家樂(lè)養(yǎng)殖服務(wù)站。
1.2.1 鯽魚(yú)魚(yú)露制備工藝流程
鯽魚(yú)魚(yú)糜→解凍,均質(zhì)→加水和食鹽煮沸10 min→冷卻加大豆麩皮曲→35 ℃,95% RH產(chǎn)酸發(fā)酵9天→接種魯氏酵母→增香發(fā)酵40天。
1.2.2 樣品的制備
首先通過(guò)前期的單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定了米曲霉產(chǎn)酸發(fā)酵階段和魯氏酵母增香發(fā)酵階段最佳發(fā)酵條件為:魚(yú)糜與水的質(zhì)量比1∶2,發(fā)酵溫度35 ℃,加鹽量13%,米曲霉種曲接種量30%,產(chǎn)酸發(fā)酵時(shí)間9天;增香發(fā)酵階段魯氏酵母接種量10%,發(fā)酵溫度30 ℃,時(shí)間40天。
準(zhǔn)確稱(chēng)取鯽魚(yú)魚(yú)糜500 g,加水1000 mL于高速勻漿機(jī)(6000 r/min,5 min)均質(zhì)成漿狀,加入13%食鹽后常溫蒸煮至沸騰,并保持沸騰狀態(tài)10 min[10]。將煮沸的魚(yú)糜湯趁熱轉(zhuǎn)至預(yù)先滅菌的5000 mL三角瓶中,封口膜封口。冷卻后在超凈工作臺(tái)中加450 g大豆麩皮混合均勻后于恒溫恒濕35 ℃,95% RH產(chǎn)酸發(fā)酵9天。再接入菌濃度為109的魯氏酵母150 mL于30 ℃,95% RH增香發(fā)酵40天結(jié)束。分別在發(fā)酵第0,3,6,9,15,20,30,40,50天取樣品醬醪液100 g,于5000 r/min離心15 min,用藥匙移除上層油脂得到魚(yú)露樣品,用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行氨基酸指標(biāo)檢測(cè)。
1.2.3 樣品的分析
用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行氨基酸指標(biāo)檢測(cè)。經(jīng)過(guò)處理后的魚(yú)露樣品上柱分析。上柱的樣品量根據(jù)自動(dòng)分析儀的靈敏度來(lái)確定。一般為每種氨基酸0.1 μmol左右(水解樣品干重為0.3 mg 左右)。測(cè)定必須在pH 5~5.5、100 ℃下進(jìn)行,反應(yīng)進(jìn)行時(shí)間為10~15 min,生成的紫色物質(zhì)在570 nm 波長(zhǎng)下進(jìn)行比色測(cè)定,而生成的黃色化合物在440 nm 波長(zhǎng)下進(jìn)行比色測(cè)定,做一個(gè)氨基酸全分析需1 h 左右,同時(shí)可將幾十個(gè)樣品一起裝入儀器,自動(dòng)按序分析,最后自動(dòng)計(jì)算給出精確的數(shù)據(jù)含量。
表1 發(fā)酵過(guò)程中游離氨基酸的變化
注:?jiǎn)挝籱g/dL;*表示必需氨基酸。
醬油中的氨基酸是游離態(tài)的氨基酸,醬油的含氮量50%~75%是游離態(tài)的氨基酸[11]。醬油的氨基酸組成復(fù)雜,氨基酸不僅是醬油最重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),也是醬油重要的調(diào)味成分之一[12]。由表1可知,在鯽魚(yú)魚(yú)露發(fā)酵過(guò)程中,氨基酸檢測(cè)除沒(méi)有檢測(cè)到羥基脯氨酸外,其他21種氨基酸均有檢測(cè)到,這說(shuō)明在用鯽魚(yú)發(fā)酵魚(yú)露的過(guò)程中并不會(huì)產(chǎn)生羥基脯氨酸。
圖1 發(fā)酵過(guò)程中氨基酸總含量的變化
由圖1可知,發(fā)酵開(kāi)始的第0天時(shí),鯽魚(yú)膏中的氨基酸含量較少,為2.5 mg/dL,但發(fā)酵3天后,氨基酸含量迅速增長(zhǎng),高達(dá)3713.92 mg/dL,這是因?yàn)榘l(fā)酵開(kāi)始之后,各種蛋白酶的酶活力增加,迅速將鯽魚(yú)蛋白分解為各種游離氨基酸,之后因?yàn)榇蟛糠值鞍踪|(zhì)水解完,故第3天之后的氨基酸含量變化較小,總體維持在該含量水平。說(shuō)明利用二段發(fā)酵法制取鯽魚(yú)魚(yú)露時(shí),蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生氨基酸的過(guò)程主要集中在前3天,發(fā)酵過(guò)程比較迅速,而后期主要是一些風(fēng)味物質(zhì)的形成及增香過(guò)程。
構(gòu)成人體蛋白質(zhì)必需的氨基酸共有8種,分別為蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴(lài)氨酸和色氨酸[13]。醬油作為人們獲取8種必需氨基酸的重要來(lái)源之一,這8種必需氨基酸含量是評(píng)價(jià)醬油好壞的重要指標(biāo)[14]。WHO/FAO標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定人體必需氨基酸與總氨基酸的比值和必需氨基酸與非必需氨基酸的比值分別為40%和60%[15]。食物中這兩者的比例越接近該值,食物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值就越高。低鹽鯽魚(yú)魚(yú)露發(fā)酵過(guò)程中必需氨基酸占總氨基酸的百分比變化見(jiàn)圖2。
圖2 發(fā)酵過(guò)程中必需氨基酸總含量及百分比的變化
由圖2可知,必需氨基酸占總氨基酸的百分比除了第0天的58%外,其他時(shí)間一直穩(wěn)定在40%,與WHO/FAO的規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)非常接近,說(shuō)明低鹽鯽魚(yú)魚(yú)露具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。
表2 發(fā)酵過(guò)程中必需氨基酸的含量與WHO/FAO標(biāo)準(zhǔn)模式譜的比較
由表2可知,8種必需氨基酸占醬油總的氨基酸的最終百分比各不相同,其中苯丙氨酸的最終百分比變化為3%,明顯低于WHO/FAO標(biāo)準(zhǔn)模式譜的百分比6%。這表明鯽魚(yú)魚(yú)露中的苯丙氨酸含量較低,應(yīng)該在鯽魚(yú)魚(yú)露的發(fā)酵過(guò)程中采取措施提高苯丙氨酸的含量,比如添加一些富含苯丙氨酸的輔料,以滿足人體所需此氨基酸的平衡,從而達(dá)到飲食結(jié)構(gòu)均衡。
除苯丙氨酸之外,其他必需氨基酸在醬油中的最終百分比含量基本都符合WHO/FAO標(biāo)準(zhǔn)模式譜的百分比。其中賴(lài)氨酸的百分比含量最高達(dá)到8.7%,蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和色氨酸的最終百分比分別為5.4%,7.4%,5.3%,8.6%,1.1%,甲硫氨酸最終百分比為2.7%,略低于WHO/FAO標(biāo)準(zhǔn)模式譜的百分比3.5%。以上分析表明,鯽魚(yú)魚(yú)露中的必需氨基酸含量較高,基本符合WHO/FAO標(biāo)準(zhǔn)模式譜的標(biāo)準(zhǔn)。
圖3 發(fā)酵過(guò)程中賴(lài)氨酸含量及百分比的變化
賴(lài)氨酸屬于人體的第一必需氨基酸,在人體新陳代謝過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[16]。由圖3可知,低鹽鯽魚(yú)魚(yú)露發(fā)酵過(guò)程中的賴(lài)氨酸含量起始3天明顯增加,之后維持在320 mg/dL上下,最高時(shí)達(dá)到354.34 mg/dL。賴(lài)氨酸在總氨基酸含量中的百分比一直維持在8%以上,最終穩(wěn)定在9%左右,而由表2可知,WHO/FAO標(biāo)準(zhǔn)模式譜的賴(lài)氨酸在醬油中的百分比含量為5.5%,說(shuō)明低鹽鯽魚(yú)魚(yú)露中的賴(lài)氨酸符合WHO/FAO標(biāo)準(zhǔn)模式譜的規(guī)定,鯽魚(yú)魚(yú)露可作為人體賴(lài)氨酸的重要來(lái)源。日常生活中的谷物蛋白中賴(lài)氨酸較少[17],因此可以很好地利用鯽魚(yú)魚(yú)露來(lái)彌補(bǔ)谷物蛋白中賴(lài)氨酸的不足,調(diào)整其比例,利于人體吸收,維持人體正常代謝。
圖4 發(fā)酵過(guò)程中γ-氨基丁酸含量及百分比的變化
γ-氨基丁酸是一種天然存在的功能性氨基酸,是目前研究較為深入的一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),能參與多種代謝活動(dòng),具有很高的生理活性[18]。γ-氨基丁酸有鎮(zhèn)靜神經(jīng),抗焦慮的作用,還能降低血壓[19]。日本的研究表明γ-氨基丁酸對(duì)Kupperman綜合癥具有顯著的改善效果[20]。中日研究表明γ-氨基丁酸還能降低血氨,解除氨毒,促進(jìn)大腦細(xì)胞的功能恢復(fù)。Yuan Y Y等[21]研究認(rèn)為γ-氨基丁酸與孕酮協(xié)同作用,能明顯促進(jìn)精子的獲能,提高精子的體外能力。此外,γ-氨基丁酸具有防止動(dòng)脈硬化,調(diào)節(jié)心律失常的作用,并且可防止皮膚老化[22]。
由圖4可知,γ-氨基丁酸的含量在鯽魚(yú)魚(yú)露發(fā)酵過(guò)程中最高達(dá)到0.21 mg/mL,百分比含量最終穩(wěn)定在0.4%。根據(jù)相關(guān)研究表明,醬油中的 γ-氨基丁酸含量雖然較低,但是其生理作用巨大。因此,該鯽魚(yú)魚(yú)露醬油可補(bǔ)充人體γ-氨基丁酸,以調(diào)節(jié)人體重要的生理活性。
圖5 發(fā)酵過(guò)程中呈味氨基酸總含量及百分比的變化
呈味氨基酸的含量和組成決定醬油味道鮮美的程度[23]。呈味氨基酸可以分為鮮、甜、芳香3類(lèi)[24],蛋白質(zhì)中的天門(mén)冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、脯氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等氨基酸被稱(chēng)作呈味氨基酸[25]。其中呈鮮味的特征氨基酸是天門(mén)冬氨酸和谷氨酸,而呈甜味的特征氨基酸是甘氨酸和丙氨酸,絲氨酸、脯氨酸、蘇氨酸也和呈甜味有關(guān)[26]。酪氨酸和苯丙氨酸是呈現(xiàn)芳香味的氨基酸[27]。如果醬油中這些呈味氨基酸的含量較高,那么醬油的味道就更鮮美。由圖5可知,魚(yú)醬油呈味氨基酸(DAA)占總游離氨基酸(TFAA)的比例(DAA/TFAA)從發(fā)酵第3天后都維持在96%以上,說(shuō)明鯽魚(yú)魚(yú)露中的呈味氨基酸十分豐富。
圖6 發(fā)酵過(guò)程中鮮味類(lèi)氨基酸總含量及百分比的變化
在高含量的呈味氨基酸中,又以鮮味類(lèi)氨基酸最多。鮮味類(lèi)氨基酸包括天門(mén)冬氨酸和谷氨酸2種,由圖6可知,鮮味氨基酸從最初的3.6%逐漸增加到了31.6%,并且總體水平維持在30%左右,鯽魚(yú)魚(yú)露中鮮味類(lèi)氨基酸達(dá)到了1.2 mg/mL,是呈味氨基酸中含量最多的,這說(shuō)明該鯽魚(yú)魚(yú)露與其他大多數(shù)醬油一樣,滋味以鮮味為主。
圖7 發(fā)酵過(guò)程中甜味類(lèi)氨基酸總含量及百分比的變化
甜味類(lèi)氨基酸包括絲氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸和蘇氨酸5種[28],醬油中的甜味類(lèi)氨基酸除了提供醬油清香甜味以外,還可以減輕苦味,有效除去食品中不愉快的氣味[29]。由圖7可知,鯽魚(yú)魚(yú)露發(fā)酵過(guò)程中,甜味類(lèi)氨基酸由最初的12.8%增加到26.4%,是僅次于鮮味類(lèi)氨基酸的呈味氨基酸。
圖8 發(fā)酵過(guò)程中芳香族類(lèi)氨基酸總含量及百分比的變化
芳香族類(lèi)氨基酸主要包括酪氨酸和苯丙氨酸2種[30],由圖8可知,芳香族類(lèi)氨基酸與鮮味類(lèi)氨基酸和甜味類(lèi)氨基酸不同,在鯽魚(yú)魚(yú)露發(fā)酵過(guò)程中,芳香族類(lèi)氨基酸占總氨基酸的百分比呈現(xiàn)下降的趨勢(shì),由最初的15.2%下降到4.3%,但芳香族類(lèi)氨基酸的絕對(duì)量還是有所增加的。鯽魚(yú)魚(yú)露中芳香族類(lèi)氨基酸含量雖少,但其特有的香味能賦予醬油特有的滋味。
實(shí)驗(yàn)制得的鯽魚(yú)魚(yú)露不僅含有種類(lèi)豐富的氨基酸,而且氨基酸的含量也較高。所含的氨基酸包含人體的8種必需氨基酸,且必需氨基酸的比例在魚(yú)露中的比例維持在40%,符合WHO/FAO標(biāo)準(zhǔn)模式譜的規(guī)定。醬油中的人體第一必需氨基酸——賴(lài)氨酸在鯽魚(yú)魚(yú)露中同樣含量豐富,占總氨基酸的比例高達(dá)8.7%,遠(yuǎn)超過(guò)WHO/FAO標(biāo)準(zhǔn)模式譜的5.5%。醬油具有爽口的鮮味和宜人的香味主要與其含有呈味氨基酸有關(guān),而鯽魚(yú)魚(yú)露醬油中含有豐富的呈味氨基酸,占總氨基酸的97%之多,其中以鮮味類(lèi)氨基酸居多,甜味類(lèi)氨基酸次之,芳香族類(lèi)氨基酸較少,共同構(gòu)成了鯽魚(yú)魚(yú)露的獨(dú)特滋味。綜上所述,二段法發(fā)酵生產(chǎn)的鯽魚(yú)魚(yú)露中氨基酸較為均衡,其具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。