于愛軍 趙魯文 陳凱 劉金龍 傅華 李劍

【摘? 要】目的：研究結(jié)直腸癌組織中podoplanin標(biāo)記微淋巴管的特點(diǎn)，探討其與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法：收集承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院手術(shù)切除結(jié)直腸癌和癌旁組織標(biāo)本34例及正常結(jié)直腸組織標(biāo)本20例，用MaxVision法免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)podoplanin表達(dá)，計(jì)算podoplanin標(biāo)記的微淋巴管密度（MLVD），并結(jié)合結(jié)直腸癌臨床病理特征進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果：結(jié)直腸癌旁MLVD（22.53±4.93）明顯高于腫瘤中心區(qū)（7.44±1.78）（P<0.01），兩者均明顯高于正常結(jié)直腸組織（5.40±1.88）（P<0.01）。結(jié)直腸癌旁高M(jìn)LVD與腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Dukes分期（P<0.01）有關(guān)，與患者的性別、年齡均無(wú)關(guān)。結(jié)論：結(jié)直腸癌旁高M(jìn)LVD與腫瘤組織的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。腫瘤旁MLVD是判斷腫瘤淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)。

【關(guān)鍵詞】結(jié)直腸癌;Podoplanin;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移;微淋巴管密度;免疫組織化學(xué)

結(jié)直腸癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類健康，其發(fā)病率在我國(guó)高居惡性腫瘤第三位。淋巴道轉(zhuǎn)移是其轉(zhuǎn)移的主要途徑，大多數(shù)結(jié)直腸癌早期就可以發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移^[1]。近年來(lái)隨著新型淋巴管標(biāo)記物的出現(xiàn)，腫瘤新生淋巴管形成與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系逐漸成為研究的熱點(diǎn)。本研究運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)Podoplanin在34例結(jié)直腸癌中的表達(dá)，計(jì)算結(jié)直腸癌中微淋巴管密度（micro-lymphatic vessel density， MLVD），探討它們與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2017年5月～2018年5月手術(shù)切除結(jié)直腸標(biāo)本34例，其中男性20例，女性14例;年齡35～78歲，中位年齡53.6歲。組織學(xué)分型：高分化腺癌8例、中分化腺癌16例、低分化腺癌10例。臨床Dukes分期： A+B期18例、C+D期16例。全部病例術(shù)前均未行化療或放療，術(shù)后均經(jīng)病理確診。每例標(biāo)本取結(jié)直腸癌、癌旁組織（距瘤緣小于1cm）各1塊。另外隨機(jī)選取其中20例距離腫瘤10cm以上遠(yuǎn)的組織作為正常對(duì)照。

1.2方法

全部標(biāo)本經(jīng)4%甲醛固定、石蠟包埋、連續(xù)切片（厚4μm）、常規(guī)HE染色及免疫組化MaxVision兩步法染色。兔抗人Podoplanin單克隆抗體購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，MaxVision試劑盒購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行?？乖迯?fù)采用EDTA（PH8.0）高壓鍋高溫修復(fù)，DAB顯色，中性樹膠封片。

1.3 淋巴管計(jì)數(shù)

Podoplanin陽(yáng)性染色定位于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒狀。參照Weidner報(bào)道的方法對(duì)微淋巴管密度進(jìn)行計(jì)數(shù)，Podoplanin染色后，單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇著色陽(yáng)性分別計(jì)為一個(gè)陽(yáng)性微淋巴管，不一定要找到完整的管狀結(jié)構(gòu)，先在低倍鏡（×40倍）下分別選取結(jié)直腸癌周邊區(qū)、中心區(qū)以及正常結(jié)直腸組織Podoplanin染色陽(yáng)性微淋巴管最豐富的區(qū)域，即“熱點(diǎn)（hot spots）”，然后在高倍鏡（×200）視野下計(jì)數(shù)MLVD，每例計(jì)數(shù)3個(gè)視野，并求其均值^[2]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均用SPSS for Windows 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理，所有計(jì)數(shù)資料用表示，組間比較用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.01。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌及癌旁組織中微淋巴管形態(tài)特征及淋巴管密度分析

結(jié)直腸癌旁組織MLVD明顯高于癌及正常組織（表1），癌組織內(nèi)淋巴管多塌陷、閉塞，少量為狹窄的腔隙，癌旁組織淋巴管管腔形狀不規(guī)則，多有不同程度的擴(kuò)張，腔內(nèi)有時(shí)可見少量淋巴細(xì)胞，偶見有癌細(xì)胞。正常組織中淋巴管分布于粘膜層、粘膜下層、肌層和外膜中，形態(tài)大小不一，壁較薄。

2.2 結(jié)直腸癌組織中淋巴管密度與臨床病理因素的關(guān)系

結(jié)直腸癌中心區(qū)MLVD與結(jié)直腸癌臨床病理各因素之間無(wú)相關(guān)性。但在結(jié)直腸癌旁MLVD與腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Dukes分期（P<0.01）有關(guān)，而與患者性別、年齡均無(wú)關(guān)（表2）。

3 討論

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要生物學(xué)特征，也是臨床治療失敗、致死的主要原因之一^[3]。在實(shí)體惡性腫瘤中， 淋巴系統(tǒng)可能早于血液系統(tǒng)，成為腫瘤轉(zhuǎn)移的最初途徑^[4]。在腫瘤生長(zhǎng)的早期，尤其是轉(zhuǎn)移瘤生長(zhǎng)早期，其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的提供主要靠彌散方式及微淋巴管、新生淋巴管通過(guò)擴(kuò)張形式提供，且隨著腫瘤生長(zhǎng)淋巴管數(shù)量也在增加，管壁結(jié)構(gòu)發(fā)生改變^[5]，因此惡性腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移過(guò)程中起關(guān)鍵作用的是淋巴管的生成。由于以前缺乏特異的淋巴管標(biāo)志物，長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)腫瘤淋巴管的研究相對(duì)滯后于對(duì)腫瘤血管的研究，隨著近年來(lái)相繼發(fā)現(xiàn)了腎小球足突細(xì)胞膜黏蛋白（Podoplanin），血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（VEGFR）-3，腫瘤胚胎性抗原M-A的單克隆抗體（D2-40），淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體（LYVE）-1等能特異性標(biāo)記淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的抗體，極大地方便了對(duì)淋巴管與腫瘤關(guān)系的研究。淋巴管生成也成為腫瘤研究新的熱點(diǎn)， 抑制腫瘤新生淋巴管為控制腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移提供了新的靶點(diǎn)^[6]。

Podoplanin首先在患有嘌呤霉素所誘導(dǎo)的腎病鼠模型的腎小球足突細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)，是分子量為43KD的Ⅰ型黏液樣跨膜糖蛋白，由166個(gè)氨基酸構(gòu)成，有一個(gè)單一高度保守的跨膜區(qū)域，胞內(nèi)域有9個(gè)氨基酸構(gòu)成，胞質(zhì)內(nèi)的C端有兩個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，胞外域有一個(gè)相對(duì)保守的6個(gè)潛在的氧連接型糖基化位點(diǎn)^[7]。Podoplanin主要表達(dá)于生長(zhǎng)中和成熟的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞表面，在血管內(nèi)皮細(xì)胞上不表達(dá)，是特異性較強(qiáng)的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物^[8]。本研究結(jié)果顯示，未在由Podoplanin標(biāo)記的微淋巴管內(nèi)發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞，有的微淋巴管內(nèi)可見淋巴細(xì)胞，少數(shù)微淋巴管內(nèi)可以發(fā)現(xiàn)癌栓，血管內(nèi)皮細(xì)胞均未表達(dá)，這表明Podoplanin標(biāo)記微淋巴管的特異性和敏感性較好。

Schoppmann等研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織內(nèi)新生淋巴管由單層內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成，缺乏連續(xù)的基底膜，內(nèi)皮細(xì)胞連接疏松，有許多潛在腔隙，通透性增加，從而使腫瘤細(xì)胞容易進(jìn)入淋巴管，形成淋巴轉(zhuǎn)移^[9]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中大多數(shù)是由單層內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成的淋巴管，這些內(nèi)皮細(xì)胞間的連接稀疏，存在很多潛在腔隙。癌旁組織的MLVD高于癌組織及正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)直腸癌中MLVD與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，微淋巴管的形成為腫瘤轉(zhuǎn)移提供了有利條件。雖然已經(jīng)證明癌組織中存在新生淋巴管，但癌組織與癌旁淋巴管形態(tài)存在明顯差異，腫瘤內(nèi)部淋巴管多因腫瘤細(xì)胞的擠壓而導(dǎo)致塌陷、閉塞，癌旁組織的淋巴管的形態(tài)大多數(shù)是增生擴(kuò)張的。腫瘤內(nèi)部淋巴管可能沒(méi)有功能，功能性淋巴管主要位于癌旁，由于癌旁增生的功能性淋巴管增加了腫瘤細(xì)胞與淋巴管接觸的面積，從而促使了腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移^[10]。

本研究顯示，Podoplanin可以特異性標(biāo)記淋巴管上皮細(xì)胞，結(jié)直腸癌癌旁MLVD與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期顯著相關(guān)，新生淋巴管在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中有重要作用。檢測(cè)腫瘤及癌旁組織內(nèi)MLVD可以作為評(píng)估結(jié)直腸癌生物學(xué)行為的一項(xiàng)指標(biāo)。檢測(cè)MLVD可能有助于評(píng)估結(jié)直腸癌患者的預(yù)后并指導(dǎo)臨床治療。

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