北京北大維信生物科技有限公司（100094）石海清 周守岫 王曉峰

《中國藥典》2015年版四部規(guī)定洛伐他汀含量測定（高效液相色譜法）的測定方法，適用于本公司紅曲的洛伐他汀含量測定，此產(chǎn)品的含量測定前，樣品使用超聲波樣品處理方法進(jìn)行處理；用使用因子（影響樣品處理質(zhì)量的過程變量：溫度、超聲水位、樣品裝載量、樣品）設(shè)計(jì)試驗(yàn)，對紅曲樣品洛伐他汀含量測定中在超聲水槽中的位置進(jìn)行調(diào)查，確定影響樣品處理的因素，并通過驗(yàn)證確定該方法中超聲波樣品處理的影響因素和最佳條件，以保證樣品處理方法用于洛伐他汀含量測定時(shí)，能夠有效地控制上樣前樣品的質(zhì)量，從而確定本公司實(shí)驗(yàn)室的樣品處理的影響因素及樣品處理的最佳條件。

1 風(fēng)險(xiǎn)評估

1.1 為了保證本實(shí)驗(yàn)室紅曲樣品洛伐他汀含量測定（高效液相色譜法）超聲波處理方法的處理質(zhì)量，規(guī)避或?qū)L(fēng)險(xiǎn)控制在可接受范圍內(nèi)，進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估。紅曲樣品處理方法為超聲處理1小時(shí)。

1.2 以風(fēng)險(xiǎn)得分RPN為評估原則。使用FMEA法進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)的原則，以風(fēng)險(xiǎn)得分RPN為評估依據(jù)。RPN由可能性得分、嚴(yán)重性得分、可檢測性得分相乘得到，即：風(fēng)險(xiǎn)得分RPN=可能性得分×嚴(yán)重性得分×可檢測性得分。風(fēng)險(xiǎn)得分（RPN）分值越高，風(fēng)險(xiǎn)越大；分值越低，風(fēng)險(xiǎn)越小。風(fēng)險(xiǎn)按高低分為：高級風(fēng)險(xiǎn)H：風(fēng)險(xiǎn)得分12～27，此風(fēng)險(xiǎn)必須降低。中級風(fēng)險(xiǎn)M：風(fēng)險(xiǎn)得分8～9，此風(fēng)險(xiǎn)必須降低至盡可能低。低級風(fēng)險(xiǎn)L：風(fēng)險(xiǎn)得分3～6，此風(fēng)險(xiǎn)必須降低至盡可能低。微小風(fēng)險(xiǎn)S：風(fēng)險(xiǎn)得分1～2，通?？梢越邮艿娘L(fēng)險(xiǎn)。見附表1。

通過風(fēng)險(xiǎn)分析，需對該方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。通過系統(tǒng)地調(diào)查影響樣品處理質(zhì)量的過程變量，確定影響樣品處理質(zhì)量的過程條件，有針對性地進(jìn)行設(shè)備改進(jìn)，并將樣品處理?xiàng)l件實(shí)現(xiàn)最優(yōu)化，以增強(qiáng)樣品處理的的可靠性、質(zhì)量和重現(xiàn)性。

2 儀器設(shè)備、試驗(yàn)用具和試劑試液

儀器設(shè)備：高效液相色譜儀、超聲波清洗器、電子天平、離心機(jī)。試驗(yàn)用具：移液管、容量瓶。試劑試液：洛伐他汀對照品、甲醇、中性氧化鋁。

3 對照品與供試品制備

3.1 對照品溶液的制備 精密稱取洛伐他汀對照品10mg，置50ml量瓶中，加甲醇適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取5ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得（每1ml中含洛伐他汀40μg）。對照品溶液需制備2份平行溶液。

3.2 供試品溶液的制備 取供試品，混勻，研細(xì)，精密稱定，紅曲1.0g，置15ml具塞離心管中，精密加75%乙醇10ml，密塞，搖勻，稱定重量，超聲處理（60分鐘，功率250W，頻率28kHz）取出，放冷，再稱定重量，用75%乙醇補(bǔ)充減失的重量（減失重量小于0.05g不需要補(bǔ)重），搖勻，離心（10分鐘，2000轉(zhuǎn)/分鐘）。精密量取上清液3ml，置25ml量瓶中定容，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.3 測定 對照品溶液與供試品溶液進(jìn)樣量均為10μl，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。

3.4 計(jì)算公式 計(jì)算公式1：對照品響應(yīng)因子F=Cr /Ar；計(jì)算公式2：對照品平均響應(yīng)因子；計(jì)算公式3：對照品響應(yīng)因子的相對偏差；計(jì)算公式4：含量Cx=(供試品峰面積Ax×/稱樣量m)×10×25/3000。

4 驗(yàn)證過程

4.1 紅曲樣品洛伐他汀含量測定 測定方法：使用一般全因子設(shè)計(jì)（1/2）對紅曲樣品洛伐他汀含量測定中影響樣品處理質(zhì)量的過程變量：溫度、超聲水位、樣品裝載量、樣品在超聲水槽中的位置進(jìn)行調(diào)查，每種過程變量使用2～3個(gè)設(shè)置條件，由此形成正交實(shí)驗(yàn)表。按實(shí)驗(yàn)表列明的條件進(jìn)行同一個(gè)紅曲樣品處理并進(jìn)行洛伐他汀含量測定，測定結(jié)果使用MINITAB（版本17）進(jìn)行方差分析，確定影響樣品處理質(zhì)量的過程條件。樣品洛伐他汀含量測定結(jié)果見附表2。

4.2 結(jié)果處理方法與數(shù)據(jù)分析標(biāo)準(zhǔn)

4.2.1 結(jié)果處理 對洛伐他汀含量測定結(jié)果使用MINITAB（版本17）進(jìn)行方差分析，以對樣品處理?xiàng)l件中對結(jié)果影響顯著的條件應(yīng)進(jìn)行篩選。篩選出結(jié)果影響顯著的因子進(jìn)一步篩選條件。篩選出結(jié)果影響顯著的連續(xù)因子條件作為因子進(jìn)行一般全因子設(shè)計(jì)（2個(gè)重復(fù)），利用響應(yīng)優(yōu)化挑選洛伐他汀含量測定結(jié)果最高的一組條件相應(yīng)水平作為相應(yīng)樣品的最佳樣品處理?xiàng)l件。

4.2.2 結(jié)論及判定 符合“結(jié)果處理”中優(yōu)選條件的樣品處理方法建議作為樣品處理?xiàng)l件?！敖Y(jié)果處理”中與優(yōu)選條件的洛伐他汀含量均值相差2.0%之內(nèi)的條件對樣品測定影響很小，亦可判定為符合要求的樣品處理?xiàng)l件。如上述2項(xiàng)均不能篩選出滿足的樣品處理?xiàng)l件，應(yīng)改變影響因素的種類和水平重新驗(yàn)證。

4.2.3 數(shù)據(jù)分析 對方案形成的正交實(shí)驗(yàn)表，測定結(jié)果使用MINITAB（版本17）進(jìn)行方差分析，確定影響樣品處理質(zhì)量的過程條件，詳見附表3。

4.2.4 從檢驗(yàn)結(jié)果可以看出，紅曲（干）洛伐他汀含量測定結(jié)果不受溫度、水位、樣品裝載、樣品位置影響（P值大于顯著性水平0.05）。

綜上，通過檢測結(jié)果可見，紅曲（干）洛伐他汀含量測定洛伐他汀含量測定的溫度、水位、樣品裝載、樣品位置條件如附表4。

附表1 風(fēng)險(xiǎn)失效模式分析評估表及風(fēng)險(xiǎn)應(yīng)對措施

附表2 紅曲樣品洛伐他汀含量測定正交實(shí)驗(yàn)表

附表3 樣品洛伐他汀含量測定結(jié)果分析匯總

附表4 洛伐他汀含量測定條件列表