趙麗紅，陳 威，高艷嬌，肖 靜

(遼寧工業(yè)大學(xué)土木建筑工程學(xué)院，遼寧錦州121001)

微生物資源具有可再生性，其開發(fā)利用具有廣闊的前景。選育具有優(yōu)良性狀、高產(chǎn)等性能的優(yōu)良菌株，是開發(fā)利用微生物資源的首要任務(wù)。然而野生菌株一般很難達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)的要求，所以就需要一定的育種方法對野生菌株進(jìn)行改良，以得到具有所需優(yōu)良性狀的菌株。目前傳統(tǒng)育種技術(shù)操作簡單，也比較成熟，但是獲得目的性狀菌株的過程復(fù)雜、耗時(shí)長、工作量巨大、效率低、盲目性高。現(xiàn)代分子生物學(xué)手段雖然取得了一定的發(fā)展，但是須要對微生物進(jìn)行定向的基因操作，技術(shù)要求十分高，欠缺基因型和表型相應(yīng)的背景，不利于廣泛推廣?；蚪M重排技術(shù)在這樣的背景下應(yīng)運(yùn)而生。Zhang等在2002年首次提出基因組重排技術(shù)，其基本原理是基于原生質(zhì)體融合技術(shù)將多個(gè)親本的全DNA基因組進(jìn)行重組，從而快速得到具有融合各親本優(yōu)良性狀的子代。他們成功將該技術(shù)用于提高弗氏鏈霉菌合成泰樂菌素的能力，并取得了顯著成果，使弗氏鏈霉菌合成泰樂菌素的能力得到極大提高［1］。

基因組重排技術(shù)是一種在分子定向進(jìn)化基礎(chǔ)上發(fā)展而來的新型分子育種技術(shù)，它將重組的對象從單個(gè)基因擴(kuò)展到整個(gè)基因組，從雙親本擴(kuò)展到多親本，從一輪原生質(zhì)體融合擴(kuò)展到多輪原生質(zhì)體融合，因此可以對菌株的目的性狀進(jìn)行更快以及更大范圍的優(yōu)化組合［2］。

1 基因組重排的方法與原理

基因組重排技術(shù)主要由構(gòu)建親本庫、原生質(zhì)體遞歸融合、目的表型的篩選3個(gè)過程組成。每個(gè)過程都有自己的特點(diǎn)和一定的技術(shù)手段。Gong等給出了基因組重排技術(shù)的操作流程［3］，如圖1 所示。

1.1 構(gòu)建親本庫(parental library)

基因組重排技術(shù)的初始菌株應(yīng)該包含更多的基因型，收集相關(guān)菌株以形成親本庫，能為后面的原生質(zhì)體融合提供可靠的基礎(chǔ)。初始菌株的種群多樣性和菌株豐富的表型是進(jìn)行基因組重排技術(shù)的第1步。

目前構(gòu)建親本庫的主要方法還是經(jīng)典的方法如突變和直接篩選等，其中突變是獲得豐富基因型的主要方法，在這個(gè)過程中，須要使用化學(xué)誘變劑或者物理誘變方式對原始菌株進(jìn)行誘變處理。如劉源慧分別利用紫外誘變和微波誘變方法對米曲霉(Aspergillus oryzae)FS－16進(jìn)行誘變，從得到的誘變菌株中選取α－淀粉酶產(chǎn)量較高的突變株與原始菌株FS－16作為親本，然后進(jìn)行基因組重排，最后得到α－淀粉酶酶活較高的子代菌株［4］。

構(gòu)建親本庫時(shí)，為了獲得豐富的基因型主要是采用組合的方式。篩選菌株的主要方法根據(jù)目的表型，比如產(chǎn)量和環(huán)境耐受性等?？墒蔷甑纳L性狀也應(yīng)該被給予足夠的重視，因?yàn)閾碛休^高產(chǎn)量和環(huán)境耐受性菌株的生長性狀可能會(huì)受到損害。因此，構(gòu)建親本庫時(shí)應(yīng)采集野生菌株，以促進(jìn)復(fù)雜子代的生長特性。其次，通過合理的方式獲得的菌株也可以作為基因組重排的出發(fā)菌株。應(yīng)用合理的篩選方法可以擴(kuò)大親本菌株的篩選范圍，從而能增大經(jīng)過基因組重排技術(shù)處理后獲得目的表型的概率。

1.2 原生質(zhì)體的遞歸融合(recursive protoplast fusion)

基因組重排是基于原生質(zhì)體融合技術(shù)(protoplast fusion)的育種技術(shù)。原生質(zhì)體的多輪遞歸融合使細(xì)胞之間的基因轉(zhuǎn)移頻率大大增加。在原生質(zhì)體的遞歸融合過程中，來自親本的原生質(zhì)體經(jīng)歷混合(mix)、融合(fusion)、再生(regeneration)等過程。然后從再生的原生質(zhì)體中選出性狀優(yōu)良的菌株，作為下一輪原生質(zhì)體融合的出發(fā)菌株。同時(shí)親本菌株基因的多樣性在原生質(zhì)體遞歸融合的操作下能夠被擴(kuò)充到子代中，這樣有利于得到目的表型。

經(jīng)典的基因組重排技術(shù)主要依賴于PEG(聚乙二醇)誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合，但PEG誘導(dǎo)存在效率低、重組菌不穩(wěn)定、易退化、須制備雙親本原生質(zhì)體等缺點(diǎn)，這極大阻礙了基因組重排技術(shù)在微生物中的育種應(yīng)用。目前，使用化學(xué)藥劑和電脈沖法誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合是主要的方法。Skelley等在細(xì)胞融合前利用微流體裝置對細(xì)胞進(jìn)行排列，這很大程度上提高了原生質(zhì)體融合的效率［5］，同時(shí)原生質(zhì)體的再生率也是基因組重排取得成功的關(guān)鍵。Imada等研究表明，原生質(zhì)體的再生率在液體再生培養(yǎng)基中優(yōu)于固體平板［6］。

1.3 目的表型的篩選(selectionofdesiredphenotype)

確?；蚪M重排技術(shù)成功的重要步驟是目的表型的篩選。盡管可以在特定的培養(yǎng)基上培養(yǎng)子代以獲得特定的抗性菌株，但是過量代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生一直以來都被認(rèn)為是進(jìn)行表型篩選的難點(diǎn)。傳統(tǒng)篩選改良菌株的方式取決于菌株的生理生化特性，如在瓊脂平板上的水解圈、透明圈和抑菌圈等。John等利用乳酸融合菌能夠直接水解淀粉這一特性，根據(jù)乳酸融合菌水解淀粉產(chǎn)生的透明圈的大小篩選出了高產(chǎn)乳酸融合菌［7］。另外，利用遺傳標(biāo)記的方法也可以篩選融合菌株。Dai等利用菌體營養(yǎng)缺陷型的遺傳標(biāo)記成功標(biāo)記了革蘭氏陰性細(xì)菌的目的融合子［8］。

通過滅活原生質(zhì)體篩選融合子的方法也有一定應(yīng)用，原生質(zhì)體通過加熱或紫外線照射最終達(dá)到滅活的目的。理論上，一種特定的滅活方式可能在染色體的同一位點(diǎn)帶來損害，如果幾個(gè)親本原生質(zhì)體采用同樣的方法滅活，將會(huì)給融合子再生帶來困難;但是染色體上不同位點(diǎn)的損傷卻可以得到互補(bǔ)修復(fù)，所以一般需要采用不同滅活方式提高融合子再生率。Kang等分別采用紫外線和熱滅活的方式處理親本原生質(zhì)體，最終篩選出理想的表型融合子［9］。近年來，高通量的篩選方法得到了很快發(fā)展，如熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)、液相色譜質(zhì)譜法等，這些新技術(shù)使融合子的篩選效率得到了顯著提高。

2 基因組重排技術(shù)的優(yōu)勢

傳統(tǒng)育種方法曾發(fā)揮著很大的作用，但缺點(diǎn)是工程量巨大、耗時(shí)長且難以獲取復(fù)雜表型［10－12］。作為新興的育種技術(shù)，基因組重排在微生物育種方面擁有許多傳統(tǒng)育種技術(shù)所無法比擬的優(yōu)勢。

2.1 基因組重排技術(shù)是多親本基因水平上的轉(zhuǎn)移

基因組重排技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)多親本基因水平上的轉(zhuǎn)移。利用原生質(zhì)體融合技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，以實(shí)現(xiàn)多親本、遠(yuǎn)源親本間的基因組轉(zhuǎn)移、重排，很大程度上增加了多重優(yōu)良性狀在子代出現(xiàn)的概率。如Yamashita等通過灰色鏈霉菌和天神島鏈霉菌種間基因組重排，篩選到1株重組子菌株，此菌株可產(chǎn)生抗生素吲哚佐霉素(indolizomycin)［13］。王航等將篩選到的鏈霉素抗性菌株(Str－70)與慶大霉素抗性菌株(Gen－139)作為出發(fā)菌株進(jìn)行多輪基因組重排，最終得到的菌株(SG4－34)同時(shí)具有2種抗性且多殺菌素產(chǎn)量與原始菌株相比提高6倍［14］。

2.2 基因組重排技術(shù)避免菌株產(chǎn)生“疲勞效應(yīng)”

傳統(tǒng)誘變育種技術(shù)由于長期使用誘變劑，菌株自身抗性會(huì)得到增強(qiáng)，最終造成菌株產(chǎn)生“疲勞效應(yīng)”?；蚪M重排是利用原生質(zhì)體遞歸融合技術(shù)來改良的菌株，整個(gè)過程只有1次誘變，所以避免產(chǎn)生“疲勞效應(yīng)”等現(xiàn)象。

2.3 基因組重排技術(shù)快速高效

傳統(tǒng)誘變育種是對單一原始菌株用傳統(tǒng)的誘變方法進(jìn)行誘變，以得到有利的突變性狀，過程繁瑣、時(shí)間漫長且存在較大的盲目性?；蚪M重排技術(shù)獲得正突變菌株只須1次誘變，然后利用原生質(zhì)體遞推式融合技術(shù)改良菌株，這個(gè)過程涉及多親本全基因組范圍的遺傳信息交換，獲得正突變性狀的速度大大提高，同時(shí)也更加高效。如Zhang等發(fā)現(xiàn)，對菌株進(jìn)行2輪基因組重排所達(dá)到的成果，相當(dāng)于傳統(tǒng)誘變育種需要20 年才能完成［1］。

2.4 基因組重排技術(shù)簡化了育種過程

通過定向進(jìn)化工程、DNA重組技術(shù)、生物學(xué)和代謝工程手段等，雖然也可以獲得理想的優(yōu)良性狀，從而實(shí)現(xiàn)定向進(jìn)化，但是這些技術(shù)須要巨大的人力物力去了解目標(biāo)菌株的遺傳背景與規(guī)律。基因組重排技術(shù)的對象是親本的全基因組，進(jìn)行隨機(jī)交換重組，并篩選出帶有目的性狀的優(yōu)良菌株，這個(gè)過程不用了解微生物的遺傳背景，省去了大量繁重的工作，極大地提高了育種速率與效率。

3 基因組重排技術(shù)的應(yīng)用

基因組重排技術(shù)經(jīng)過十幾年的發(fā)展充分融合了細(xì)胞工程和誘變育種的特點(diǎn)，在微生物育種以及獲得代謝產(chǎn)物等方面體現(xiàn)出了很明顯的優(yōu)勢。而且基因組重排技術(shù)在提高菌株代謝產(chǎn)物產(chǎn)率、增強(qiáng)菌株耐受性、提高底物利用率和范圍以及改造微生物的代謝途徑等方面均取得了較大的發(fā)展。

3.1 提高產(chǎn)物產(chǎn)率

基因組重排技術(shù)可以快速得到帶有目的表型的菌株，同時(shí)可以有效地優(yōu)化、調(diào)節(jié)多基因控制的性狀，以提高菌株的產(chǎn)量。目前，在提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)率方面已經(jīng)有了許多成功的應(yīng)用。

El－Gendy等以諾卡氏菌阿萊2000菌株為原始菌株，通過基因組重排技術(shù)篩選出綾霉素產(chǎn)量很高的目的菌株。首先通過傳統(tǒng)的誘變技術(shù)在原始菌株的基礎(chǔ)上得到改良菌株，在改良菌株的基礎(chǔ)上又進(jìn)行基因組重排，并以綾霉素產(chǎn)量作為篩選指標(biāo)，通過3輪基因組重排后最終得到目的菌株，目的菌株的綾霉素產(chǎn)量是原始菌株的19倍，是改良菌株的1.9倍［15］。Zheng等利用濃縮的高效液相色譜法篩選出產(chǎn)生丁二酸濃度較高的菌株，然后將所篩選的菌株作為初始菌株，經(jīng)過3輪基因組重排，得到子代菌株丁二酸的產(chǎn)量比親本菌株提高約73%［16］。Chalopagorn等利用基因組重排技術(shù)提高嗜熱芽孢桿菌屬的脂肪酶產(chǎn)量，將芽孢桿菌屬CF03菌株經(jīng)過紫外線照射和甲磺酸乙酯(EMS)誘變，以所獲得的誘變菌株為初始菌株，經(jīng)過2輪基因組重排，得到融合菌株(FB1)，與野生型菌株相比，F(xiàn)B1菌株的生長率和脂肪酶的產(chǎn)量最高分別增加了150%和238%［17］。表1總結(jié)了基因組重排技術(shù)在提高產(chǎn)物產(chǎn)率方面的應(yīng)用。

表1 基因組重排技術(shù)在提高產(chǎn)物產(chǎn)率方面的應(yīng)用

3.2 增強(qiáng)菌株對環(huán)境的耐受性

目前，基因組重排技術(shù)在增強(qiáng)菌株對酸、鹽、產(chǎn)物、底物、溶解氧、副產(chǎn)物及溫度等因素的耐受性方面已有很多成功的應(yīng)用。Patnaik等利用基因組重排技術(shù)篩選出了耐酸性更強(qiáng)的乳酸菌菌株［30］。Dai等利用基因組重組技術(shù)成功得到了能耐受8 mmol/L五氯苯酚(PCP)的融合子，并且此融合子能夠在48 h內(nèi)完全降解3 mmol/L PCP［31］。2008年王立梅等利用基因組重組技術(shù)得到了能夠在pH值為3.6的環(huán)境下生長且L－乳酸產(chǎn)量達(dá)到5.67 g/L，發(fā)酵溫度達(dá)到40℃的菌株［32］。Cao等以異常漢遜酵母菌株作為原始菌株，通過3輪基因組重排得到目的菌株，其具有很高的耐鹽性能和pH值生長范圍［33］。Zheng等以來自原始菌株釀酒酵母的紫外線突變體為出發(fā)菌株，經(jīng)過2輪基因組重排得到重組菌株YZ2，此重組菌株在乙酸壓力下顯示出更快生長速度和細(xì)胞生存能力［34］。Zheng等在谷氨酸棒狀桿菌原始菌株的基礎(chǔ)上經(jīng)過紫外線照射和耐高溫等傳統(tǒng)誘變技術(shù)手段篩選出5株菌株，將此5株菌株又通過3輪基因組重排技術(shù)得到1株目的菌株，經(jīng)過試驗(yàn)與分析，目的菌株的L－谷氨酸的產(chǎn)量比原始菌株產(chǎn)量提高了1.8倍，耐熱性也得到了一定的提高［35］。黃俊等采用基因組重排技術(shù)有效而快速地獲得了在產(chǎn)乙醇能力和乙醇耐受力方面都更好的里氏木霉菌株［36］。Li等通過連續(xù)4輪基因組重排，獲得丙酮丁醇梭菌的融合菌株，融合菌株在耐熱性、溶劑耐受性及環(huán)境穩(wěn)定性方面比野生菌均有進(jìn)一步提高［37］。

3.3 提高底物利用率及其范圍

微生物對底物的利用率和范圍是菌株非常重要的目的表型，基因組重排技術(shù)在提高微生物底物利用率及范圍方面也有著重要的成果。如John等以德氏乳酸桿菌和產(chǎn)淀粉酶的枯草芽孢桿菌為親本菌株，利用基因組重排技術(shù)，篩選到了能直接轉(zhuǎn)化淀粉為乳酸的子代菌株［7］。Zhao等將輪枝霉(Diasporangium sp.)和黑曲霉作為親本菌株，利用基因組重排技術(shù)得到的新菌株可以利用全部8種碳源，而親本僅僅能利用 4種碳源［38］。Kang等把出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)N3.387作為基因組重排的出發(fā)菌株，通過基因組重排后獲得融合菌株F3－2，相比于野生菌株，融合菌株對底物的利用率提高了29.0%［39］。Zhou等利用基因組重排技術(shù)，從鏈霉菌中篩選出不僅ε－聚賴氨酸產(chǎn)量高，且對產(chǎn)物ε－聚賴氨酸具有一定抗性的融合菌株［40］。

3.4 改造微生物的代謝途徑

在基因組重排技術(shù)中隨著整個(gè)基因組片段的重排，可以使細(xì)胞表型得到快速改進(jìn)，細(xì)胞的代謝途徑也可以得到一定的優(yōu)化。基因組重排能夠激活菌株內(nèi)部某些沉默基因而獲得新的代謝產(chǎn)物。如Wang等在利用基因組重排技術(shù)提高瘤座霉屬(Tubercularia sp.TF5)菌株的紫杉醇產(chǎn)量試驗(yàn)中，在子代融合子的代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了8種新結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。這些物質(zhì)與直接親本和原始菌株所產(chǎn)的同類物質(zhì)結(jié)構(gòu)均不同，這說明子代融合子所產(chǎn)生的新物質(zhì)是基因組重排后某些沉默基因被激活 表 達(dá) 造 成 的［41］。Cao 等 對 魯 氏 接 合 酵 母(Zygosaccharomyces rouxii)進(jìn)行3輪基因組重排后獲得1株融合菌株，其能產(chǎn)生親本菌株無法產(chǎn)生的新的化合物［42］。

4 展望

基因組重排技術(shù)的研究對象為微生物細(xì)胞內(nèi)整套基因組，不須要探究菌株的遺傳背景，利用多輪循環(huán)式基因組重排篩選，將多個(gè)優(yōu)良性狀集中到子代目的菌株中，這是傳統(tǒng)育種技術(shù)、原生質(zhì)體融合技術(shù)和DNA重排技術(shù)所不具有的獨(dú)特優(yōu)勢，是微生物育種技術(shù)中的具有里程碑式意義的進(jìn)步。正突變基因庫的建立是基因組重排技術(shù)中關(guān)鍵一步，其多樣性以及與目的性狀的相關(guān)性直接關(guān)系到重排能否成功，所以正突變基因庫的構(gòu)建方面還需要更多的探索。傳統(tǒng)的化學(xué)融合、電融合等融合效率較低，新興的融合技術(shù)如微流體技術(shù)、激光誘導(dǎo)技術(shù)等雖然融合效率較高，但是使用范圍較窄，所以可能還須要進(jìn)一步探索新的原生質(zhì)體融合技術(shù)。在融合子的篩選方面，目前常用的方式是熱滅活與紫外滅活標(biāo)記，這2種方式會(huì)對原生質(zhì)體帶來一定的生理損傷，影響融合效率，因此還須要高通量的篩選方法來保證基因重排技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展。目前，盡管基因組重排技術(shù)在克服不同親本細(xì)胞重組成功率較低問題，以及高效篩選融合菌株等方面還存在一定程度的挑戰(zhàn)，但是隨著基因組重排技術(shù)與其他生物技術(shù)如代謝工程、基因組學(xué)等相結(jié)合以及多種高通量、高效率篩選策略的出現(xiàn)，基因組重排技術(shù)將會(huì)有更快的發(fā)展和更廣闊的應(yīng)用。