李艷艷，王俊青，李植良，孫保娟

(1.平頂山學(xué)院，河南平頂山467000;2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，廣東廣州510640;3.廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510640)

茄子(Solanum melongena L.)為茄科茄屬蔬菜作物，在世界各地廣泛栽培。我國(guó)是世界上最大的茄子生產(chǎn)國(guó)，華南地區(qū)不僅是我國(guó)茄子的主要生產(chǎn)區(qū)，也是我國(guó)茄子的主要出口地區(qū)。廣東省地處亞熱帶，茄子春、秋兩季種植，其生長(zhǎng)和收獲正值高溫季節(jié)，田間溫度可達(dá)40℃以上，惡劣的天氣條件成為制約茄子生長(zhǎng)發(fā)育的重要因素。茄子生長(zhǎng)的適宜溫度為22～30℃，在溫度達(dá)到35℃以上時(shí)，其生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段都會(huì)表現(xiàn)出一定的高溫傷害癥狀，如葉片灼傷、花器官發(fā)育不良、坐果率下降、畸形果增多等，進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)的下降［1－4］。高溫會(huì)引起植物葉片生理代謝紊亂和細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變，對(duì)光合系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生破壞［5］。目前，有關(guān)高溫脅迫對(duì)不同耐熱性茄子苗期細(xì)胞生物學(xué)方面，特別是對(duì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化的影響還鮮見報(bào)道。本研究以熱敏茄子品系05－1和耐熱茄子品系05－4為試驗(yàn)材料，通過比較不同高溫脅迫時(shí)間下葉肉細(xì)胞質(zhì)膜、葉綠體及線粒體結(jié)構(gòu)的變化情況，旨在為從細(xì)胞學(xué)角度揭示茄子的耐熱性提供一些參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用茄子材料是由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所選育的、苗期熱脅迫鑒定及田間自然高溫鑒定均表現(xiàn)為耐熱的親本自交系05－4和熱敏感的親本自交系05－1［2－3］。其中05－4為華南特色紫紅長(zhǎng)茄骨干系親本自交系，05－1為從北方茄子類型中分離出來的自交系。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物材料的處理 各供試品種的種子經(jīng)催芽后，采用穴盤育苗，待幼苗具有4～5張真葉時(shí)放入人工智能光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，晝—夜溫度為28℃—25℃，光—暗周期為12 h—12 h，預(yù)培養(yǎng) 3 d，濕度保持在70% ～80%，再進(jìn)行高溫(43℃)處理，光—暗周期為12 h—12 h。從莖端開始數(shù)選取處理組和對(duì)照組植株第3張真葉。將材料分為2組，1組進(jìn)行高溫(43℃)處理，另1組仍在原培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)作為對(duì)照，濕度保持不變。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)至少20株。

1.2.2 方法 超薄切片法參照李正理的方法［6］，分別在高溫脅迫0、2、6、12 h后取材，從莖端開始數(shù)選取處理組和對(duì)照組植株第3張真葉，在其葉片中部主脈與邊緣取約1 mm長(zhǎng)×1 mm寬的小組織塊，迅速固定于用磷酸緩沖液(pH值為7.2)配制的4%戊二醛中，用1%鋨酸溶液進(jìn)行后固定，于4℃ 固定8～12 h，用磷酸緩沖液沖洗3次，再用0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH值為7.2)配制的1%鋨酸溶液常溫固定3 h，之后用磷酸緩沖液沖洗3次，用不同濃度乙醇脫水，環(huán)氧丙烷過渡，Epon812環(huán)氧樹脂包埋，奧地利Reichert－Jung超薄切片機(jī)切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色，在日立H－600Ⅱ型透射電鏡下觀察和拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 正常生理狀態(tài)下不同耐熱性茄子葉片葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

由圖1－a可以看出，熱敏品系05－1葉肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，膜結(jié)構(gòu)完整平滑、緊貼胞壁，細(xì)胞中央有大液泡，液泡周圍是1薄層細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有豐富的細(xì)胞器，葉綠體排列在細(xì)胞的周圍。葉綠體呈橢圓形或或梭形，被膜清晰，類囊體片層疊垛整齊，片層結(jié)構(gòu)發(fā)達(dá)，葉綠體內(nèi)有小的、少量的脂質(zhì)小球(圖1－b、圖1－c)。線粒體近圓形，多分布于2個(gè)葉綠體交界處，雙層膜完整，含有豐富的峭(圖1－c)。耐熱品系05－4葉肉細(xì)胞結(jié)構(gòu) (圖 1－d、圖 1－e、圖1－f)類似于05－1，但其葉綠體淀粉顆粒數(shù)量較多。

2.2 短期高溫脅迫下不同耐熱性茄子的葉片葉肉細(xì)胞超徽結(jié)構(gòu)

經(jīng)熱脅迫2 h后，熱敏品系葉肉細(xì)胞與對(duì)照相比部分部位發(fā)生了明顯的質(zhì)壁分離，質(zhì)壁分離處的質(zhì)膜與液泡膜處出現(xiàn)膜被小泡(圖1－g的黑色箭頭);細(xì)胞質(zhì)電子密度沒有對(duì)照的大;葉綠體彎曲或膨大，葉綠體被膜變得不光滑，并出現(xiàn)斷裂(圖1－h(huán)的黑色箭頭)，脂質(zhì)小球增多(圖1－h(huán)、圖1－i的白色箭頭);線粒體結(jié)構(gòu)完整(圖1－i)。而耐熱品系脂質(zhì)小球增多(圖1－j的白色箭頭)，葉綠體彎曲或膨大，但細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常(圖1－j、圖1－k、圖1－l)。

熱脅迫6 h時(shí)，熱敏品系葉肉細(xì)胞葉綠體繼續(xù)膨大變圓，內(nèi)部脂質(zhì)小球增多(圖1－m的白色箭頭)，葉綠體被膜出現(xiàn)不同程度的斷裂、解體，類囊片層由于葉綠體膨大而被拉長(zhǎng)扭曲(圖1－n);線粒體嵴開始變得模糊(圖1－o)。耐熱品系細(xì)胞也發(fā)生部分質(zhì)壁分離，熱脅迫降低了基質(zhì)的電子密度，質(zhì)膜與液泡膜處出現(xiàn)膜被小泡(圖1－q、圖1－r)，葉綠體出現(xiàn)彎曲或膨大。

熱脅迫12 h時(shí)，熱敏品系細(xì)胞收縮嚴(yán)重，細(xì)胞間隙擴(kuò)大，細(xì)胞質(zhì)中被膜小泡增多(圖1－s)。由于基質(zhì)大量外流，有的葉綠體內(nèi)出現(xiàn)空洞，類囊體片層松散，結(jié)構(gòu)紊亂(圖1－t);線粒體嵴和內(nèi)膜數(shù)量減少或雙層膜模糊，并逐漸解體，有些細(xì)胞的液泡膜被破壞(圖1－u)。耐熱品系細(xì)胞也出現(xiàn)葉綠體繼續(xù)膨大變圓的情況(圖1－v)，葉綠體被膜出現(xiàn)部分?jǐn)嗔眩惸移瑢佑捎谌~綠體膨大而被拉長(zhǎng)，線粒體嵴開始變得模糊(圖1－w、圖1－x)，但細(xì)胞結(jié)構(gòu)仍然完整。

3 討論

王洪春綜合分析了各種脅迫條件下植物的生理生化反應(yīng)，認(rèn)為質(zhì)膜的生理生化和物理等特性的變化是植物抗性生理最初和最基本的反應(yīng)［7］。耐熱品系與熱敏品系分別在熱脅迫6、2 h時(shí)葉肉細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離，并且質(zhì)壁分離處的質(zhì)膜與液泡膜處出現(xiàn)大量膜被小泡，這與在豇豆的組織培養(yǎng)細(xì)胞和小麥?zhǔn)艿綗崽幚頃r(shí)觀察到液泡膜和質(zhì)膜上形成的泡狀物相似［8－9］，這是受到熱脅迫時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)的較早的結(jié)構(gòu)變化，這一現(xiàn)象有可能作為細(xì)胞受到脅迫時(shí)的超微結(jié)構(gòu)指標(biāo)。推測(cè)這是脂類脫離膜而形成一些液泡化的小囊泡，從而破壞膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致膜喪失選擇透性與主動(dòng)吸收的特性，使膜透性增大［10］。但是，對(duì)于小泡的形成機(jī)制有待今后的進(jìn)一步研究。

葉綠體是植物細(xì)胞中對(duì)熱脅迫比較敏感的細(xì)胞器。在高溫脅迫下，熱敏品系比耐熱品系較早出現(xiàn)葉綠體趨于變圓并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中間，葉綠體被膜出現(xiàn)不同程度的斷裂、解體，類囊體片層膨脹松散。并且2個(gè)品系在熱脅迫下葉綠體內(nèi)都出現(xiàn)數(shù)量多、體積大的質(zhì)體球體，這些現(xiàn)象與馬曉娣等觀察到的結(jié)果一致［9，11－13］。這是細(xì)胞遭受高溫等逆境脅迫時(shí)的又一特征性變化，這與在其他逆境、黃化和衰老葉片中觀察到的結(jié)果相似［14－15］。在高溫脅迫下，作為一種代謝產(chǎn)物，質(zhì)體球體的逐漸增多，預(yù)示著細(xì)胞的衰老和解體?？梢?，造成茄子葉片光合作用降低的一個(gè)重要原因可能就是葉片葉綠體超微結(jié)構(gòu)的變化和損傷。熱脅迫下2個(gè)品系葉片中葉綠體淀粉顆粒均減少甚至消失，這種現(xiàn)象在與豇豆(Vigna unguicula)的組織培養(yǎng)細(xì)胞、菜豆幼苗和番茄花期受到熱處理時(shí)觀察到的質(zhì)體內(nèi)淀粉顆粒的變化［8，13，16］一致。

此外，本試驗(yàn)觀察到在葉肉細(xì)胞中，葉綠體對(duì)高溫最敏感，葉綠體遭到破壞解體的時(shí)間早于線粒體，這與大多數(shù)研究者認(rèn)為的在逆境條件下線粒體比葉綠體結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定的結(jié)論相同［11，16－18］，但在小麥上也有相反的報(bào)道［7］，也許是由于小麥葉片在離體條件下受到了熱脅迫。其相對(duì)穩(wěn)定的線粒體結(jié)構(gòu)，有利于利用貯藏同化產(chǎn)物進(jìn)行呼吸消耗，提供能量以維系細(xì)胞最基本的生命活動(dòng)，不會(huì)引起細(xì)胞迅速崩潰死亡，從而使得植物在逆境解除后得以恢復(fù)生長(zhǎng)［18］。同時(shí)也說明，在逆境情況下，植物首先是降解自身儲(chǔ)備的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但“能量加工廠”線粒體被破壞時(shí)，植物將無法恢復(fù)生存能力。在葉綠體中，類囊體膜在熱脅迫下表現(xiàn)出現(xiàn)排列紊亂，這與關(guān)于葉綠體在高溫脅迫下導(dǎo)致光合反應(yīng)的熱失活是在不耐熱的類囊體膜上的觀點(diǎn)一致［11，19］。同時(shí)，筆者觀察到葉綠體被膜卻比類囊體膜解體時(shí)間更早，葉綠體被膜對(duì)熱脅迫更為敏感的原因有待進(jìn)一步研究。熱敏品系比耐熱品系較早出現(xiàn)超微結(jié)構(gòu)的變化，這也與證明了筆者前期測(cè)定耐熱品系較高含量的AsA(抗壞血酸)、GSH(谷胱甘肽)和可溶性糖［20］對(duì)細(xì)胞膜的完整性和細(xì)胞正常功能的保護(hù)作用。

綜合分析可知，不同耐熱性品系的質(zhì)膜、葉綠體及線粒體在高溫脅迫過程中的超微結(jié)構(gòu)變化是其耐熱性差異的重要基礎(chǔ)，可以作為茄子耐熱性評(píng)價(jià)的結(jié)構(gòu)指標(biāo)，用于不同基因型茄子耐熱資源的篩選。