韓曉雨 張景翔 閻瀾

(1.海軍軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員二大隊(duì)學(xué)員五隊(duì)，上海 200433；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院軍特藥研究中心，上海 200433)

近年來(lái)隨著大量抗生素、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑的應(yīng)用，以及器官移植術(shù)的開(kāi)展，真菌感染日漸增多，尤其是需要重癥監(jiān)護(hù)的患者[1]。而在所有的真菌感染中，又以白念珠菌最多見(jiàn)。膿毒性念珠菌感染患者的死亡率超過(guò)30%[2]。真菌感染是重癥監(jiān)護(hù)人群中高發(fā)病率，高死亡率的最常見(jiàn)原因之一。侵襲性念珠菌病 (invasive candidiasis，IC)是實(shí)體器官移植受者 (organ transporter，OTR)死亡的常見(jiàn)原因，其中最常見(jiàn)的物種是白念珠菌 (46.3%)[3]。隨著真菌對(duì)經(jīng)典抗真菌藥物耐藥性的日漸增加，尋找新的抗真菌藥物靶點(diǎn)刻不容緩。白念珠菌液泡對(duì)菌絲生長(zhǎng)和致病力至關(guān)重要，因此，研究真菌液泡功能及其發(fā)揮作用的機(jī)制有助于尋找抗真菌化合物新靶點(diǎn)及篩選新的化合物。

液泡是真菌細(xì)胞中類(lèi)似哺乳動(dòng)物細(xì)胞中溶酶體的一種細(xì)胞器，為一種較大的酸化細(xì)胞器，具有降解大分子、儲(chǔ)存營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、耐受外界壓力，維持鈣和金屬離子的穩(wěn)態(tài)[4]，內(nèi)吞和分泌途徑中的膜運(yùn)輸?shù)裙δ躘5]。真菌液泡是一種高度動(dòng)態(tài)的細(xì)胞器，白念珠菌由無(wú)毒力的酵母相轉(zhuǎn)變?yōu)橛卸玖Φ木z相時(shí)也要經(jīng)歷液泡的動(dòng)態(tài)變化。液泡主要通過(guò)促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)及提高白念珠菌對(duì)應(yīng)激的反應(yīng)能力兩方面來(lái)幫助白念珠菌發(fā)揮其毒力[6-7]。在液泡生物發(fā)生中具有嚴(yán)重缺陷的突變菌株是無(wú)侵襲力的。通過(guò)抑制液泡膜質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶 (Vacuolar-type H+-ATPase，V-ATPase)功能和通過(guò)V-ATP酶抑制劑酸化酵母液泡，也可以降低白念珠菌的毒力。白念珠菌的菌絲在宿主的定植和侵襲期間起著重要作用，而菌絲的生長(zhǎng)又受到液泡的調(diào)節(jié)，因此通過(guò)抑制液泡的功能來(lái)降低白念珠菌的侵襲力是理想的抗真菌策略?，F(xiàn)對(duì)白念珠菌液泡重要功能蛋白研究進(jìn)展作一綜述。

1 V-ATPase

液泡功能取決于液泡V-ATPase維持酸性pH值[8]。V-ATPase存在于液泡膜，由V0、V1亞基組成，通過(guò)將H+從細(xì)胞質(zhì)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)入液泡內(nèi)從而維持液泡內(nèi)酸化，對(duì)蛋白質(zhì)加工和降解，內(nèi)吞運(yùn)輸，pH驅(qū)動(dòng)的胞吐作用，代謝物、離子和毒性藥物的運(yùn)輸和隔離等發(fā)揮重要作用[9]，也是白念珠菌維持侵襲力所必需的蛋白之一。V-ATPase活性受損會(huì)削弱白念珠菌侵襲感染過(guò)程中許多因素：如毒力因子 (利于菌絲侵入的酶)的分泌，菌絲向宿主細(xì)胞的侵入，生物被膜形成，抵抗宿主固有免疫力和產(chǎn)生對(duì)抗真菌藥物的耐受性。VMA基因缺失菌缺乏V-ATPase活性，不能正常酸化內(nèi)膜腔，在分泌，內(nèi)體和液泡途徑中均表現(xiàn)出缺陷，在小鼠體內(nèi)無(wú)毒力[2]。

其結(jié)構(gòu)由跨膜的V0和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的V1兩個(gè)亞單位組成，前者為H+提供通道，后者能分解ATP，為逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)H+提供能量。V0和V1只有在聚合時(shí)，V-ATPase全酶才有功能。Voa亞基是唯一由兩種同種型VPH1和STV1編碼的真菌V-ATPase亞基，分別定位于高爾基體和分泌途徑，或定位于液泡膜。V-ATPase利用ATP水解將質(zhì)子從細(xì)胞質(zhì)驅(qū)動(dòng)到液泡腔，酸化液泡并調(diào)節(jié)酵母細(xì)胞中的幾種關(guān)鍵細(xì)胞反應(yīng)系統(tǒng)。在tetRVMA3菌株中抑制VMA3可阻止V-ATPase在液泡膜上組裝，使ATP酶特異性活性和質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)減少90%以上，并使康納霉素 (concanamycin)敏感性降低[10]。由V-ATPase產(chǎn)生的pH梯度是分泌途徑中許多毒力相關(guān)蛋白質(zhì) (例如天冬氨酰蛋白酶，脂肪酶，黏附和侵襲素)分泌所必需的，這有助于白念珠菌對(duì)宿主細(xì)胞的侵襲和定植[11]。此外，自噬過(guò)程需要酸性細(xì)胞腔環(huán)境來(lái)刺激負(fù)責(zé)各種降解的酶，故也需要V-ATPase。除了細(xì)胞內(nèi)pH，環(huán)境pH對(duì)白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)變也有很大影響[12]。到2009年，已經(jīng)描述了8種類(lèi)型的V-ATPase抑制劑[13]?？筕-ATPase藥物臨床使用可以避免使用唑類(lèi)物質(zhì)產(chǎn)生多重耐藥性的問(wèn)題。

2 液泡酸化

液泡酸化不僅對(duì)白念珠菌形成菌絲和建立感染的能力具有重要作用[2]，而且對(duì)于從蛋白質(zhì)分選和降解到整體離子穩(wěn)態(tài)的各種其他過(guò)程也是非常重要的[9]。微生物致病過(guò)程的關(guān)鍵是對(duì)pH的反應(yīng)。在致病性酵母如白念珠菌中，pH與真菌細(xì)胞增殖，芽殖和菌絲形態(tài)之間的二態(tài)轉(zhuǎn)換以及毒力有關(guān)[14]。釀酒酵母中V-ATPase功能的喪失導(dǎo)致1組生長(zhǎng)缺陷，統(tǒng)稱(chēng)為vma表型。vma表型的特征是不能在堿性 (pH 7.5至8.5)、含有高濃度鈣、或含有不可發(fā)酵的碳源作為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而在酸性介質(zhì)上生長(zhǎng) (pH 4.0到5.0)類(lèi)似于野生型。因此，V-ATPase功能的阻遏會(huì)干擾各種關(guān)鍵細(xì)胞過(guò)程和可能對(duì)真菌毒力很重要的應(yīng)激反應(yīng)。VMA3編碼V0C亞基，白念珠菌VMA3是液泡酸化、V-ATP酶組裝和功能，以及菌絲形成所必需的[10,15]，并有助于蛋白酶、脂肪酶分泌和絲狀化。VMA3的缺失抑制了絲狀化并導(dǎo)致異常的液泡形態(tài)。VMA3的丟失比V0a同種型VPH1的喪失更嚴(yán)重的抑制絲狀化[10]。Johnson等[16]證實(shí)了Stv1p和Vph1p在白念珠菌中具有重疊功能及V-ATPase的重要性。VPH1是白念珠菌中毒力所必需的，Vph1的破壞可導(dǎo)致天冬氨酰蛋白酶和脂肪酶的活性降低，以及絲狀缺陷，Stv1p與黏附相關(guān)蛋白的分泌有關(guān)。VMA7缺失菌株的pH耐受性喪失，鈣穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞壁應(yīng)力和呼吸缺陷[17]。胺碘酮通過(guò)堿化液泡發(fā)揮其抗真菌作用，并且在相同濃度下，也抑制白念珠菌中菌絲的形成[18]。VMA5負(fù)責(zé)編碼V1C基，VMA5的破壞導(dǎo)致生長(zhǎng)抑制，液泡功能障礙，鈣穩(wěn)態(tài)紊亂和鈣相關(guān)的氧化應(yīng)激反應(yīng)的抑制。其缺失導(dǎo)致自噬完成和菌絲發(fā)育的缺陷，并導(dǎo)致減弱的白念珠菌毒力[19]。VMA2負(fù)責(zé)編碼V1B亞基，VMA2表達(dá)的抑制導(dǎo)致氧化反應(yīng)，溫度反應(yīng)和應(yīng)激反應(yīng)的耐受性差[8,20]，導(dǎo)致不能在堿性pH下生長(zhǎng)，并且改變對(duì)鈣，低溫，抗真菌藥物和對(duì)不可發(fā)酵碳源的生長(zhǎng)的抗性。此外，V-ATP酶不能在液泡膜上完全組裝，并且質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)和ATP酶特異性活性受損。除異常液泡形態(tài)和生物發(fā)生外，VMA2抑制導(dǎo)致液泡堿化，毒力相關(guān)性狀，包括降解酶的細(xì)絲和分泌過(guò)程被顯著抑制[20]。哺乳動(dòng)物中不存在V0c'亞基的同源蛋白。因此，這種真菌特異性亞基具有很大的潛力，使其成為抗真菌藥物發(fā)現(xiàn)的理想靶標(biāo)[10]。

Vma7p與PI 3激酶Vps34p物理相互作用，PI 3激酶Vps34p是液泡蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵酶[21]。研究表明vma7缺失菌和vps34缺失菌在空泡酸化和金屬離子的解毒作用方面具有相同的缺陷，提示液泡蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)功能與液泡質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)和液泡酸化有關(guān)[17]。

3 液泡相關(guān)基因和蛋白

3.1 Tfp1

Tfp1Δ/Δ突變菌在菌絲誘導(dǎo)培養(yǎng)基中顯示出明顯受損的絲狀發(fā)育，并且在系統(tǒng)性念珠菌病的小鼠模型中是無(wú)致病力的。V1亞基Tfp1對(duì)于液泡功能和白念珠菌的發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要，并且為抗真菌藥物提供了有希望的候選物[22]。

3.2 Mlt1

Mlt1是白念珠菌中的第1個(gè)被鑒定的液泡ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (ATP-binding cassette protein)，位于液泡膜中，可以在體外將NBD-PC轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡腔中，其破壞導(dǎo)致脂質(zhì)均勻性改變[23]。Mlt1缺失不僅導(dǎo)致液泡腔中NBDPC積累的完全喪失，還可導(dǎo)致內(nèi)吞作用和毒力缺陷。Mlt1的缺失也對(duì)各種毒力相關(guān)性狀產(chǎn)生負(fù)面影響，例如菌絲形成，分泌蛋白酶活性/分泌和對(duì)氧化應(yīng)激的敏感性。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與內(nèi)吞作用是最近發(fā)現(xiàn)的一種新功能。白念珠菌的菌絲發(fā)育與內(nèi)吞作用有關(guān)，而且菌絲發(fā)育和毒力之間存在完全相關(guān)性。Mlt1p將PC轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡腔中，它影響脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)，從而導(dǎo)致內(nèi)吞作用延遲，菌絲和生物膜缺陷，藥物易感性，蛋白酶活性/分泌，氧化應(yīng)激的激活，上述同時(shí)作用以達(dá)到最大減毒效果[24]。

3.3 VPS家族

白念珠菌通過(guò)Rim/Pal蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及ESCRT/液泡蛋白質(zhì)分選組分對(duì)堿性pH環(huán)境作出應(yīng)答，其中Vps28和Vps32相互作用。VPS28和VPS32的缺失[25]，使菌株對(duì)堿性pH敏感性升高，并降低了白念珠菌的毒力[26]。此外，有一致的證據(jù)表明，破壞pH的抗真菌藥物也會(huì)阻止菌絲形成。Vps11p定位于液泡膜，白念珠菌vps11Δ/Δ菌株在液泡的生物發(fā)生和功能方面存在缺陷，如對(duì)壓力的敏感性升高，蛋白水解活性降低和嚴(yán)重的菌絲形成缺陷，并且缺乏可識(shí)別的液泡結(jié)構(gòu)[27]。Vps34p與液泡H+-ATPase Vma7p的亞基物理相互作用，Vps34p蛋白是液泡酸化和堿性pH下生長(zhǎng)所必需的。白念珠菌的vps34缺失菌的自噬作用有缺陷[28]。

4 離子穩(wěn)態(tài)

離子穩(wěn)態(tài)對(duì)于細(xì)胞基因表達(dá)，形態(tài)轉(zhuǎn)變，宿主入侵，應(yīng)激反應(yīng)，耐藥性，離子信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)均至關(guān)重要，故對(duì)于真菌存活至關(guān)重要。離子穩(wěn)態(tài)的失調(diào)迅速介導(dǎo)細(xì)胞死亡，形成了越來(lái)越多抗真菌活性的化合物的機(jī)制基礎(chǔ)。在白念珠菌中，離子可參與膜電位維持，細(xì)胞體積調(diào)節(jié)，多種酶的輔因子形成，增殖和凋亡[29]。此外，研究發(fā)現(xiàn)離子穩(wěn)態(tài)與氧化應(yīng)激反應(yīng)，形態(tài)發(fā)生，細(xì)胞壁完整性和侵襲性生長(zhǎng)密切相關(guān)。Ccc1是位于液泡中的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，當(dāng)培養(yǎng)基含有足夠量的鐵時(shí)，它參與鐵從胞質(zhì)溶膠到液泡的隔離[30]。還原鐵吸收系統(tǒng)在白念珠菌中與黏附，菌絲形成，抗真菌藥物抗性，細(xì)胞壁完整性和線(xiàn)粒體功能相協(xié)調(diào)[31-32]。破壞離子穩(wěn)態(tài)的化合物可以發(fā)揮抗真菌作用甚至逆轉(zhuǎn)白念珠菌的耐藥性。基于離子穩(wěn)態(tài)的新機(jī)制可能為尋找真菌特異性靶標(biāo)提供線(xiàn)索。

5 Vacuole Disrupting化學(xué)試劑 (VDA)

由于液泡的正常形態(tài)與功能對(duì)維持白念珠菌侵襲和致病力發(fā)揮重要作用，因此可以作為藥物候選靶點(diǎn)。液泡完整性的嚴(yán)重破壞使白念珠菌不能定殖或侵入哺乳動(dòng)物組織。破壞特定的液泡膜運(yùn)輸步驟也可以使白念珠菌對(duì)最廣泛使用的抗真菌藥物唑類(lèi)敏感[33]。約50%的VDA化合物具有真菌選擇性，不改變哺乳動(dòng)物溶酶體的形態(tài)與結(jié)構(gòu)。通過(guò)篩選發(fā)現(xiàn)9種唑類(lèi)抗真菌藥，1種他汀類(lèi)藥物和3種NSAIDs可以作為VDA顯著改變液泡數(shù)量，大小和/或形狀，這些VDA都抑制白念珠菌的菌絲形成[34-35]。9種唑類(lèi)抗真菌藥物，可抑制麥角甾醇的合成。麥角甾醇是一種調(diào)節(jié)膜雙層流動(dòng)性的脂質(zhì)，且是同型空泡體腔融合所必需的。麥角甾醇生物合成突變體具有異常的液泡形態(tài)[36]。他汀類(lèi)藥物氟伐他汀通過(guò)抑制HMGCoA還原酶阻斷甾醇生物合成，在篩選中也被鑒定為VDA，進(jìn)一步支持真菌甾醇含量在維持液泡完整性中的重要性。類(lèi)似的，對(duì)唑類(lèi)靶酶Erg11p的抑制也導(dǎo)致大量液泡破壞。之前曾有報(bào)道，在抑制白念珠菌生長(zhǎng)之前，氟康唑治療的早期結(jié)果是發(fā)生嚴(yán)重的液泡破碎。很可能影響細(xì)胞脂肪酸，磷脂或鞘脂化合物的其他種類(lèi)的小分子也會(huì)對(duì)液泡的形態(tài)和功能產(chǎn)生顯著影響[37]。擾亂液泡功能的化學(xué)試劑在多個(gè)水平損害真菌致病機(jī)理，破壞宿主體內(nèi)真菌活力。但并非所有觀察到的液泡異常都與真菌生長(zhǎng)受損一致。VDA不會(huì)導(dǎo)致液泡運(yùn)輸缺陷，但會(huì)影響白念珠菌菌絲生長(zhǎng)。NSAIDs、托芬那酸和甲芬那酸導(dǎo)致酵母形式的液泡破碎，完全消除菌絲發(fā)育[33]。

Solasodine-3-o-d-葡聚糖苷通過(guò)破壞細(xì)胞內(nèi)液泡殺滅白念珠菌。SG (Solasodine-3-o-d-Glucohexaose)使白念珠菌的細(xì)胞內(nèi)液泡堿化，并引起液泡膜的超透性增加，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。這些結(jié)果支持SG在抗真菌感染方面的潛在應(yīng)用，并揭示了1種新的殺真菌機(jī)制[38]。

丙戊酸 (VPA)改變了液泡的完整性，有助于發(fā)揮抗真菌活性。VPA也會(huì)導(dǎo)致肌醇耗盡，從而干擾液泡ATP酶功能[39-40]。白念珠菌對(duì)VPA的敏感性是pH依賴(lài)性的。與液泡運(yùn)輸和組成相關(guān)的基因缺失菌對(duì)VPA敏感，比如參與液泡蛋白分選的缺失菌 (vps15、vps34、vps64和ypt72)，與逆轉(zhuǎn)錄復(fù)合物相關(guān)的基因缺失菌 (pep7和pep8)，以及液泡遺傳和組成所需的基因缺失菌 (cla4、pep12、vam6、vps41和pep12)。全基因組篩選分別證明逆轉(zhuǎn)錄復(fù)合物和液泡ATP酶與VPA敏感性相關(guān)。VPA誘導(dǎo)的液泡表型不是內(nèi)吞作用，而是肌動(dòng)蛋白絲擾動(dòng)或肌醇耗竭的結(jié)果。液泡的完整性和體內(nèi)平衡取決于不同細(xì)胞過(guò)程的正常功能，包括肌動(dòng)蛋白絲組織[41]，內(nèi)吞作用，以及磷脂酰肌醇磷酸鹽信號(hào)傳導(dǎo)[42]。Deranieh等[40]表明VPA導(dǎo)致細(xì)胞耗盡肌醇，其破壞液泡磷酸肌醇，磷脂酰肌醇3,5二磷酸 (PI-3,-5P2)穩(wěn)態(tài)并因此損害液泡形態(tài)。這些結(jié)果支持液泡的直接改變是VPA抗真菌活性的細(xì)胞機(jī)制。同時(shí)，真菌液泡具有獨(dú)特的蛋白質(zhì)，例如V0ATPase亞基，沒(méi)有明顯的人類(lèi)同源物，可以特異性地靶向用于治療真菌感染的藥理學(xué)干預(yù)。

6 問(wèn)題與展望

由VMA11編碼且缺乏哺乳動(dòng)物同源物的真菌特異性V-ATPase亞基c’的存在進(jìn)一步支持了V-ATPase作為藥物靶標(biāo)的潛力，未來(lái)的研究可集中在VMA11和相關(guān)的V-ATPase組分對(duì)白念珠菌細(xì)胞生物學(xué)和毒力的貢獻(xiàn)[10]。通過(guò)破壞液泡功能來(lái)作為減弱白念珠菌毒力的靶標(biāo)，是完全可行的且極具發(fā)展?jié)摿?。如可以①通過(guò)與液泡膜的物理作用，損害脂質(zhì)雙層的完整性；②直接抑制負(fù)責(zé)液泡內(nèi)AIR色素生物累積的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；③改變脂質(zhì)組成，從而改變液泡膜的物理化學(xué)性質(zhì)；④破壞液泡的膜運(yùn)輸途徑；⑤直接阻斷液泡的生物發(fā)生。未來(lái)的工作可以探索pH毒性的具體貢獻(xiàn)。