梁桂紅, 華營鵬, 周婷, 宋海星, 張振華

(湖南農業(yè)大學資源環(huán)境學院, 長沙 410128)

高等植物的進化成功，很大程度上是由于它們獨特的細胞結構。液泡作為成熟植物細胞中最大的細胞器，約占細胞體積的 90%，在細胞生長發(fā)育和植物適應逆境脅迫的過程中扮演著重要角色[1-2]。作為植物細胞中一個獨特的區(qū)室結構，液泡周圍被膜包被，主要參與細胞代謝產物的累積、細胞內離子穩(wěn)態(tài)的調節(jié)、有毒物質向液泡內的區(qū)隔以及對細胞生理行為和信號轉導系統(tǒng)的調控[3-4]，液泡膜上的質子泵是參與實現(xiàn)其生理功能的關鍵因素。

植物液泡膜上有兩種功能和物理特性完全不同的質子泵，即液泡膜 ATP 酶(vacuolar H+-ATPase, V-ATPase)和液泡膜焦磷酸酶(vacuolar H+-pyrophosphatase, V-PPase)[5-6]，這兩種酶分別以 Mg·ATP 和 Mg·PPi 為底物，水解得到的 H+由胞質進入液泡中，形成細胞質與液泡間的質子電化學勢梯度，驅動各種溶質分子的跨液泡膜主動運輸[7-8]，維持細胞內的離子穩(wěn)態(tài)和滲透平衡，減少對細胞的傷害。同時，大量 H+被泵入液泡中造成液泡酸化和細胞質堿化，為細胞中各種生理生化反應提供適宜的條件，對細胞的生長發(fā)育起著重要作用。此外，液泡作為植物細胞離子養(yǎng)分的儲存庫，在逆境脅迫條件下，定位于液泡膜上的兩種質子泵 H+-ATPase 和 H+-PPase 能通過改變其結構和活性來提高植物對非生物逆境脅迫的適應能力，減少逆境脅迫對植物生長發(fā)育造成的不利影響。劉建新等[9]和 Maeshima[10]研究表明，在鹽脅迫條件下 V-ATPase 和 V-PPase 的活性均顯著增加，催化底物產生的 H+梯度能夠通過質子反向運輸機制將細胞質中過量的 Na+向液泡內運輸和積累，減少有害離子對細胞的毒害作用，保護植株在鹽脅迫等逆境條件下正常生長[11-13]。由此可見，液泡膜質子泵功能的正常發(fā)揮對植物體內各種生理活動的正常進行至關重要。

本文主要介紹了植物液泡膜上兩種質子泵的結構特征及其在植物生長發(fā)育過程中的生理功能，并對其在植物抵御非生物逆境脅迫過程中發(fā)揮的重要作用進行闡述，為加速優(yōu)質抗逆作物的育種提供方向。

1 液泡膜 H+-ATPase 和 H+-PPase 的結構特征與生理功能

1.1 液泡膜 H+-ATPase 和 H+-PPase 的結構

液泡膜作為區(qū)隔植物胞質與液泡之間物質交換的屏障，其上的兩個質子泵發(fā)揮著重要作用。液泡膜 H+-ATPase 是一個多亞基、高度保守的蛋白質復合體，分子質量為 400～650 kDa，在不同植物材料中約占液泡膜蛋白的 6%～8%，最高可達 30%[14]。V-ATPase 廣泛存在于植物細胞中，迄今已發(fā)現(xiàn)的亞基有 12 種，其中大部分亞基與酵母液泡膜 H+-ATPase 有較高的同源性[6]。液泡膜 H+-ATPase 全酶結構分為親水區(qū) V1 和疏水區(qū) V0 兩部分：其中 V1 部分由 VHA-A、VHA-B、VHA-C、VHA-D、VHA-E、VHA-F、VHA-G 和 VHA-H 亞基組成，露于胞質一側，主要負責 ATP 的水解；V0 部分由 VHA-a、VHA-c、VHA-d 和 VHA-e 等亞基組成，整合于膜中，起質子通道的作用，同時作為 V1 亞基聚合和裝配的基點(圖1A)[14-16]。與液泡膜 H+-ATPase 相比，H+-PPase 的結構簡單，由一條寡肽鏈組成，約占膜蛋白的 1%～10%[17]，廣泛存在于植物和少數(shù)藻類、原生動物以及細菌中[10]。在擬南芥中，有 3 種編碼 V-PPase 的基因，其中 1 種基因編碼 Ⅰ 型酶，叫作AtVHP1;1；另 2 種基因編碼 Ⅱ 型酶，叫作AtVHP2;1和AtVHP2;2[18]。它們分布在液泡膜上的不同區(qū)域，在細胞中參與不同的生理過程。1992 年，Sarafian等[19]第一次從擬南芥中克隆出完整的液泡膜 H+-PPase cDNA 序列，命名為AVP1(Arabidopsisvacuolar H+-pyrophosphatase)，屬于 K+激活型，對 Ca2+的抑制中度敏感；2000 年，Drozdowicz 等[20]在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了另一種液泡膜 H+-PPase 類型，與AVP1不同的是，AVP2定位在高爾基體，屬于 K+遲鈍型，對 Ca2+的抑制高度敏感。研究表明AVP2與AVP1及其他植物液泡膜H+-PPase 的序列相似性只有 36%[10]，不屬于同功酶[7]。此外，2000 年，Maeshima[10]提出了植物液泡膜 H+-PPase 的拓撲結構模型，在此模型中，液泡膜焦磷酸酶有 6 個液泡環(huán)、7 個胞質環(huán)和 14 個跨膜區(qū)域，同時具有 3 個高度保守的片段(CS1、CS2、CS3)，細胞質一側的 e 環(huán)是 V-PPase 底物的結合位點(圖1B)。

注：A：V-ATPase。黃色部分是V1亞基，綠色部分是V0亞基。B:V-PPase。CS1、CS2 和 CS3 代表高度保守的片段；數(shù)字代表14個跨膜結構域；字母(a、c、e、g、i、k 和 m)代表7個胞質環(huán)，字母(b、 d、f、h、j 和 l)代表6個液泡環(huán)。Note: A：V-ATPase. Yellow shows V1 subunits and green shows V0 subunits. B:V-PPase. CS1, CS2 and CS3 all represent highly conservative fragments. The numbers represent fourteen transmembrane domains. The letters above (a, c, e, g, i, k and m) represent seven cytoplasmic rings and the letters below (b, d, f, h, j and l) represent six vacuole rings.圖1 液泡膜V-ATPase和V-PPase的結構模型[10,16]Fig.1 Structure model of the tonoplast V-ATPase and V-PPase[10,16].

1.2 液泡膜 H+-ATPase 和 H+-PPase 的生理功能

液泡膜質子泵是含量豐富的液泡膜蛋白，表明其投入到液泡運輸中的能量是巨大的[21-22]。液泡膜質子泵通過水解底物，將產生的 H+泵入液泡，形成跨液泡膜的 H+梯度，為溶質在胞質和液泡間的跨膜轉運提供驅動力，維持胞質中各種溶質分子的相對恒定。同時，大量 H+被泵入液泡導致液泡酸化和細胞質堿化，為細胞中各種生理生化反應的進行提供適宜的內環(huán)境，保證生命活動的正常進行(圖2A)[23]。此外，液泡膜質子泵 V-ATPase 和 V-PPase 的活性與植物激素密切相關，能夠調控激素的分泌和在植物體內的分布進而影響植物的生長發(fā)育。研究表明，脫落酸對 V-ATPase 的轉錄和表達有明顯的調節(jié)作用，用 50 mmol·dm-3ABA 處理黃瓜幼苗 24 h 后，液泡膜質子泵 V-ATPase 的活性顯著增強[24]。Li 等[25]研究表明，AtAVP1基因能夠調控生長素的運輸進而影響植物的生長發(fā)育。過表達AtAVP1能夠促進生長素的運輸，加速細胞分裂；而缺失AtAVP1基因后，突變體中生長素運輸減少，根和地上部的生長發(fā)育受到顯著抑制。

注：A:pH調節(jié)。已知與建立液泡pH有關的質子泵(紅色)和轉運子(藍色)。橙色表示參與調控質子泵和轉運子的相關因子。CLCs是運輸通道蛋白；NHXs是Na+、K+/H+反向轉運體。B：有毒重金屬效應。已知與重金屬離子轉運相關的液泡膜質子泵(紅色)和轉運子(藍色)。Note: A：pH regulation. Vacuolar pumps (red) and transporters (blue) known to be implicated in establishing the vacuolar pH. Orange shows factors involved in the regulation of pumps and transporters. CLCs are Cl-, transport channel proteins and NHXs are Na+, K+/H+ antiporter. B:Toxic heavy metals transportation.Vacuolar pumps (red) and transporters (blue) known to be implicated in delivering or releasing heavy metals.圖2 液泡膜質子泵和轉運子參與液泡 pH 調節(jié)和有毒重金屬轉運[23]Fig.2 Vacuolar proton pumps and transporters involved in vacuolar pH regulation and toxic heavy metals transportation[23].

2 液泡膜 H+-ATPase 和 H+-PPase 與的關系

3 液泡膜 H+-ATPase 和 H+-PPase 與植物生長發(fā)育的關系

液泡膜質子泵水解底物產生的能量和 H+梯度，為各種溶質分子的逆濃度梯度運輸提供驅動力[7-8]，維持細胞質溶質等的相對恒定，為植物細胞中各種生理生化反應的正常進行提供條件，對細胞的生長發(fā)育起著重要作用。Li等[25]研究表明，液泡膜 H+-PPase 功能缺失型擬南芥突變體地上部和根的生長發(fā)育均受到顯著抑制，子葉畸形，多數(shù)植株因花芽分化和生殖器官的形成受到影響而不能正常結實，這些發(fā)育不正常的現(xiàn)象有可能是由于質子泵發(fā)生故障導致植物生長激素不正常分布所引起的。當液泡膜上編碼 H+-PPase 的基因AVP1功能增強時，擬南芥植株蓮座葉數(shù)目多、面積大、根系發(fā)達，且生長素運輸減少。但是，也有研究發(fā)現(xiàn)，過表達AVP1與植株蓮座葉大小和鮮重沒有直接的正相關關系[32]。當 V-ATPase 的活性缺失后，液泡不能酸化，植株生長受到抑制，表現(xiàn)出植株矮小黃化的表型，且在突變體vha-a2vha-a3中過表達AVP1并不能增大蓮座葉尺寸和生物量，對葉片細胞汁液的 pH 也沒有顯著影響，即在正常生長條件下，通過增強液泡膜 H+-PPase 的活性不能彌補液泡膜 H+-ATPase 活性的缺乏[32]。

4 液泡膜 H+-ATPase 和 H+-PPase 與非生物脅迫的關系

4.1 鹽脅迫

鹽脅迫是一種普遍存在的非生物逆境脅迫，對植物的生長發(fā)育造成不良影響。植物長期在鹽漬環(huán)境中生長，必須要克服由于土壤離子濃度高造成的滲透脅迫和離子自身產生的毒害，在長期進化過程中就會形成一系列復雜的耐鹽機制以適應外界環(huán)境。其中，液泡膜質子泵作為溶質進出細胞的動力開關，在胞內離子轉運和植物抗鹽過程中發(fā)揮著重要作用。研究表明，液泡膜上的多種離子轉運載體，能夠利用 H+-ATPase 和 H+-PPase 水解底物產生的 H+梯度，通過質子反向運輸機制將各種陽離子轉運至液泡內，維持細胞中各離子平衡，有利于植物在鹽脅迫下正常生長[11-13]。

鹽脅迫條件下液泡膜上的 Na+/H+逆向轉運蛋白可以將胞質中過量的 Na+區(qū)隔到液泡內，減輕過多 Na+累積對細胞的毒害[33]，在這個過程中，液泡膜質子泵形成的 H+梯度是 Na+/H+逆向轉運蛋白區(qū)隔離子的必要驅動力。鹽脅迫條件下，液泡膜 H+-ATPase 和 H+-PPase 活性的提高是植物表現(xiàn)耐鹽性的重要指標之一[10]。劉建新等[9]用 50、100、200、400 mmol·L-1NaCl 處理駱駝蓬幼苗，發(fā)現(xiàn)其根和葉片液泡膜 H+-ATPase 活性隨 NaCl 濃度升高而增強，當濃度為 400 mmol·L-1時，根和葉片液泡膜 H+-ATPase 活性為對照的 2.14 和 2.64 倍。鹽地堿蓬在 100 和 400 mmol·L-1NaCl 條件下處理 7 d，其葉片液泡膜 H+-ATPase 活性分別為對照的 2.71 和 2.57 倍[34]。Qiu 等[11]的研究也表明堿蓬在受 200 mmol·L-1NaCl 脅迫時，其液泡膜 H+-ATPase 和 Na+/H+反向運輸體的活性增強 2～3 倍。徐呈祥等[35]對 4 個棗品種耐鹽性與液泡膜質子泵活性關系的研究發(fā)現(xiàn)，耐鹽性強的棗品種，液泡膜質子泵的活性較高，根尖細胞向質外體的“排鹽”功能和向液泡內的“固鹽”功能均增強，葉片細胞向質外體的“排鹽”功能基本不變，而向液泡內的“固鹽”功能顯著增強，鹽脅迫下耐鹽性弱的棗品種葉片液泡膜質子泵活性下降或略有增強。液泡膜質子泵的活性對鹽脅迫的響應也不盡相同。張敏等[36]研究發(fā)現(xiàn)，構樹幼苗根和葉組織在低濃度 NaCl 處理下，根組織液泡膜 H+-ATPase 的活性提高，當 NaCl 濃度為 150 mmol·L-1時，H+-ATPase 活性有所下降。播種 8 d 的高粱種子用 NaCl 處理不同時間發(fā)現(xiàn)，第 1 d時根和葉鞘液泡膜 H+-ATPase 活性顯著增強，第 2 d時活性降至對照水平，到第 7 d時活性明顯低于對照，呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢[37]。定位在液泡膜上的另一種質子泵 V-PPase 活性同樣在鹽脅迫下有所變化。2001 年，Gaxiola 等[38]首次將AVP1基因轉入擬南芥中發(fā)現(xiàn)，過表達植株在 250 mmol·L-1NaCl 培養(yǎng)10 d 后能正常生長，葉面積和鮮重顯著增加，抗鹽能力增強，同時發(fā)現(xiàn)其AVP1蛋白水平顯著高于野生型。Duan 等[39]發(fā)現(xiàn)，100～400 mmol·L-1NaCl 處理 5 min，過量表達液泡膜 H+-PPase 的轉基因煙草葉肉細胞的存活率均比野生型更高，表現(xiàn)出更強的耐鹽性。Krebs 等[30]用 50 和 100 mmol·L-1NaCl 處理培養(yǎng)4 d 的擬南芥幼苗發(fā)現(xiàn)，其液泡膜上 H+-PPase 的活性均增強。盡管液泡膜上的兩個質子泵在響應鹽脅迫方面發(fā)揮著類似的功能，但H+-ATPase和 H+-PPase 的貢獻并不完全相同。Wang 等[40]研究表明，鹽地堿蓬受到鹽脅迫時，液泡膜 H+-ATPase 的作用更大。Yu 等[41]以耐鹽型大豆為試驗材料，卻發(fā)現(xiàn)NaCl 脅迫下根細胞液泡膜H+-PPase 的活性提高而 H+-ATPase 活性降低。這可能與試驗材料的種類、所選材料的發(fā)育狀況及脅迫程度有關?？偟膩碚f，鹽脅迫條件下，較高的液泡膜質子泵活性為 Na+區(qū)隔到液泡中提供質子驅動力，因此，鹽脅迫下液泡質子泵活性的變化是衡量植物耐鹽性的重要指標之一。

4.2 干旱脅迫

干旱脅迫也是自然界中普遍存在的非生物脅迫之一，是降低農作物產量和制約我國農業(yè)發(fā)展的主要環(huán)境因素之一。干旱脅迫容易造成植物脫水萎焉，滲透壓失衡，嚴重影響植物的正常生長發(fā)育。通過提高液泡膜質子泵活性來增大細胞內的 H+跨膜梯度，利用 Na+/H+逆向轉運蛋白將細胞質中更多的 Na+泵入到液泡，提高植物對鹽的耐受力；另一方面，可利用 NaCl 作為溶質維持滲透勢以驅動水分進入細胞，當大量 Na+被區(qū)隔到植物液泡內，細胞為維持滲透壓平衡，就會累積大量的有機滲透調節(jié)物質和無機 K+，有利于增強植株的保水性，提高植物的抗旱能力[7,39]。Gaxiola 等[39]研究表明過表達AVP1基因能顯著增強擬南芥的抗旱能力。在嚴重缺水條件下，AVP1的過表達刺激了生長素在根系中的轉運并促進根系生長，這有助于轉基因棉花在干旱條件下更有效地吸收水分并受到較少的損害，獲得更高的生物量[42]。此外，在番茄[43]、水稻[44]、煙草[12]和玉米[45]中也證實了提高液泡膜質子泵活性能增強植物對干旱的適應能力。由此可見，液泡膜質子泵活性的高低在植物應對干旱脅迫方面扮演著重要角色，對于我國農業(yè)生產具有重要的現(xiàn)實意義。

4.3 金屬陽離子脅迫

液泡膜質子泵作為胞質和液泡間物質交換屏障的動力開關，在區(qū)隔有害離子到液泡內，從而減少過量離子對細胞產生毒害方面發(fā)揮著重要作用。液泡膜上有大量金屬離子轉運蛋白，能夠依賴液泡膜質子泵水解產生的能量和 H+梯度轉運金屬離子(圖2B)[23]。鎘是一種非必需的毒性很強的重金屬，被認為是“五毒”重金屬元素之一，可以通過與膜蛋白的競爭性結合進入植物或動物細胞體內累積[46-48]，對植物的生長發(fā)育和細胞的新陳代謝具有嚴重損害[49]。鎘脅迫條件下植株會通過一系列的生理反應來減輕鎘毒害，其中陽離子交換體(cation exchangers, CAXs)和 HMA 家族在這個過程中發(fā)揮著重要作用。CAX2編碼的轉運蛋白多定位于植物液泡，主要利用兩個質子泵水解產生的 H+梯度促進植物胞質中的鎘向液泡累積[50]。HMA 家族主要利用質子泵水解釋放的能量將 Cd2+轉入液泡中，其中 HMA2 和 HMA4 負責鎘向木質部的轉運，而 HMA3 定位在根部液泡膜上，負責將鎘轉運至液泡[51-53]。Ren 等[54]研究發(fā)現(xiàn)，當培養(yǎng)4周的小麥用1 mmol·L-1鎘處理7 d時，葉片液泡膜 H+-ATPase 和 H+-PPase 的活性均顯著提高 1.5～2.5 倍，增強了植株對鎘脅迫的耐受性。液泡膜 H+-ATPase 或 H+-PPase 活性降低后，水解底物產生的 H+梯度減弱，Cd2+向液泡中的儲存減少，更多的Cd2+滯留在細胞質中，從而對細胞產生毒害，表現(xiàn)出對鎘脅迫敏感的表型，植株的生長發(fā)育受到顯著抑制。此外，液泡膜上的 Zn2+/H+逆向轉運蛋白對植物抵抗鋅毒害具有重要作用[55-56]。當培養(yǎng) 13 d 的擬南芥幼苗用50 和150 μmol·L-1ZnCl2處理時，野生型的根長減少 15% 和 25%，而突變體vha-a2vha-a3的根長生長受到更嚴重的抑制，分別減少 35% 和 65%[32]。因此，提高植物液泡膜質子泵的活性有利于植物將過多的金屬陽離子區(qū)隔到液泡中，提高植物在逆境脅迫中的耐性。

4.4 其他非生物脅迫

5 展望