張瑞霞，李海峰，馮迎娥，李靜

（1.河南省安陽農業(yè)科學院，河南 安陽 455000；2.河南省安陽市湯陰縣五陵鎮(zhèn)人民政府，河南 安陽 455000）

近年來南瓜作為一種具有天然營養(yǎng)與保健功能的蔬菜，得到了人們越來越多的重視，特別是對于南瓜育種的研究。近年來，隨著生物技術育種的不斷發(fā)展，常規(guī)育種的不足在實際工作中日漸明顯，而單倍體育種因其能通過直接加倍得到純合二倍體受到了科研工作者的青睞。南瓜為異交植物，天然雜交率高，在常規(guī)育種中利用自交的方法獲得一個純系需要多代繁育，從而使育種、雜種一代的利用和良種繁育工作加長了周期和應用年限，而單倍體育種正好可以彌補這點不足，但由于影響因素較多，所以單倍體育種還未得到廣泛的應用。為了進一步加快南瓜育種進程以及使單倍體育種應用于南瓜生產，本試驗以葫蘆科南瓜屬中的南瓜優(yōu)選自交系10-4-25的花藥為試驗材料進行花藥培養(yǎng)，通過正交設計試驗，旨在對影響南瓜花藥培養(yǎng)的因素及培養(yǎng)中出現(xiàn)的褐變、污染現(xiàn)象作初步研究，從而為南瓜屬蔬菜單倍體育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為南瓜優(yōu)選自交系10-4-25（100粒種子），由安陽市農科院提供。于2017年春季定植于安陽農科院實驗基地。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基設計

選用MS培養(yǎng)基和MS-N培養(yǎng)基，兩種培養(yǎng)基均附加蔗糖3%、瓊脂0.6%以及外源激素NAA、6-BA、2,4-D，pH值均為5.8。其中MS-N培養(yǎng)基配制時去掉了NH4NO3、KNO3等元素。試驗設計了9組激素配比方案，進行最優(yōu)激素組合試驗，每組5個培養(yǎng)皿。

1.2.2 花藥消毒與接種

試驗采用0.1%HgCl2和2%次氯酸鈉兩種消毒劑對南瓜花藥進行消毒處理。從田間采集南瓜花蕾（長2.93cm、粗0.89cm），將花蕾置于黑暗條件下，分別低溫（4℃）預處理24h和48h。用75%酒精浸泡30s后，取出用無菌水清洗1～2次，放入0.1%HgCl2中消毒7min或放入2%次氯酸鈉中消毒10min，然后取出再用無菌水沖洗4～5次。在無菌條件下，剝去花瓣，將花藥分別接種于預先配制好的MS培養(yǎng)基和MS-N培養(yǎng)基中，每瓶接種2個花蕾的花藥。接種方式為將花藥平放于培養(yǎng)基上，讓花藥與培養(yǎng)基充分接觸?；ㄋ幗臃N后，放入培養(yǎng)室內進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25～28℃，培養(yǎng)3d后開始觀察。

2 結果與分析

2.1 不同消毒試劑、消毒方法對花藥培養(yǎng)的影響

在南瓜花藥培養(yǎng)中，只有滅菌徹底才能將培養(yǎng)工作進行下去。前人的工作大多是采用0.1%HgCl2滅菌，由于南瓜花蕾大，且雨后采集的花蕾更易受污染。本試驗對比了不同消毒劑、消毒方法對花藥培養(yǎng)的影響，結果見表1無論采用何種消毒劑，用手剝取花藥消毒的感染率最高，直接消毒花藥的次之，用刀劃開花蕾取出花藥消毒的最低。另外，0.1%HgCl2消毒7min，污染率高，且效果較差；用2%次氯酸鈉消毒10min，污染率低消毒效果也較好。

2.2 培養(yǎng)基對花藥培養(yǎng)的影響

不同培養(yǎng)基對花藥培養(yǎng)的影響，結果見表2（見下頁）。由表可以看出：MS培養(yǎng)基出現(xiàn)愈傷的效果好于MS-N培養(yǎng)基，MS培養(yǎng)基的褐變率高于MS-N培養(yǎng)基，為50.7%，MS-N培養(yǎng)基雖然褐變率相對較低，但是卻發(fā)現(xiàn)接種后的花藥出現(xiàn)了直接發(fā)白死亡的現(xiàn)象。初步分析，這種現(xiàn)象可能是培養(yǎng)基中缺少有利于植物生長的氮元素的緣故。這方面的研究工作還有待于進一步的深入。

表1 不同消毒試劑、消毒方法的比較Table 1 Comparison of different disinfection reagents and disinfection methods

表2 不同培養(yǎng)基對花藥的影響Table 2 Effect of different media on anther

表3 不同培養(yǎng)組合對花藥的影響Table 3 Effects on anther of different culture combinations

2.3 不同培養(yǎng)基組合的影響

試驗設計，共設計了9組試驗組合。試驗過程中根據(jù)實際條件設計了每組5個培養(yǎng)皿，共45個培養(yǎng)皿，且每組的前2個培養(yǎng)皿所用培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，后3個培養(yǎng)皿為MS-N培養(yǎng)基。

根據(jù)表3的9組組合方案兩種培養(yǎng)基進行花藥培養(yǎng)試驗，結果表明：組合5的方案較好，接種于MS和MS-N培養(yǎng)基上的花藥均出現(xiàn)了愈傷（但隨后該愈傷發(fā)生了褐化死亡），按其他組合方案將花藥接種于不同的培養(yǎng)基后雖也有個別愈傷出現(xiàn)，但總體表現(xiàn)為不同程度的褐化現(xiàn)象，這可能與培養(yǎng)基中的無機鹽成分、蔗糖濃度和激素濃度有關。

2.4 外植體不同預處理時間對花藥培養(yǎng)的影響

表4顯示了不同預處理方法對南瓜花藥的影響，由表4可知，經低溫（4℃）預處理24h、48h后，用南瓜花藥進行培養(yǎng)，都能出現(xiàn)一定的膨大現(xiàn)象。經過低溫預處理24h和未經任何預處理的花藥獲得的愈傷組織誘導率基本上為0。48h的低溫預處理，經過12d的培養(yǎng)后，有4個花藥長出了愈傷組織。隨著培養(yǎng)時間地延長，膨大后的花藥逐漸變褐，其中有些花藥接種后直接發(fā)白死亡。

由此可以看出，處理時間越長，誘導率越高，但是褐化也越嚴重。因此要注意選擇適宜的預處理時間，從而來提高外植體的存活率。

表4 不同預處理對花藥的影響Table 4 Effects of different pretreatment on anther

花藥在離體培養(yǎng)前進行低溫預處理，適宜的低溫預處理可以提高愈傷組織和胚狀體的形成，并進一步促進植株的再生。在4℃低溫條件下，分別進行預處理24h、48h以及未經任何預處理3種方案的研究表明，4℃、48h的預處理方式中發(fā)現(xiàn)，MS培養(yǎng)基和MS-N培養(yǎng)基中均出現(xiàn)了花藥愈傷組織，但隨著培養(yǎng)時間的延長，花藥逐漸變褐，直至死亡。因此，對于低溫預處理的合適時間和合適溫度尚待繼續(xù)深入研究。

3 小結

3.1 南瓜花藥培養(yǎng)中愈傷組織誘導率偏低

從試驗結果來看，不同的材料、不同的培養(yǎng)基中南瓜花藥總體誘導率還是比較低的，這是一個普遍問題，也是現(xiàn)在國內外眾多學者的主要研究方向[4,5]。對于本試驗，材料是一個花培中未曾研究的新基因型，因此，對培養(yǎng)基、附加成份的反應都是不確定因素，盡管我們也篩選了提高南瓜花藥培養(yǎng)愈傷組織的誘導頻率的激素種類和激素組合，但其最高誘導率仍不到1%，因此，這方面的技術還有待于進一步的探討。

3.2 南瓜花藥培養(yǎng)中褐化現(xiàn)象普遍

花藥培養(yǎng)中的褐化問題一直以來都是相當普遍的，一般來說，外植體材料中單寧類和多種羥酚類化合物含量高的品種易引起褐化。試驗表明，MS培養(yǎng)基的褐變率高于MS-N培養(yǎng)基，為50.7%，這可能與培養(yǎng)基的無機鹽成分、蔗糖濃度和激素濃度等有關，因此，在初培養(yǎng)階段，應該注意選擇適宜的無機鹽成分、蔗糖濃度和激素濃度。另外，正確選擇消毒劑濃度及消毒時間，也能保證較高的外植體存活率[6]。