宋正旭，馬榮群，黃粵

（青島市農(nóng)業(yè)科學研究院，山東 青島 266100）

蘋果是多年生木本植物，生長過程中會遭受多種病毒的侵染，使得樹體生長勢減弱，直接影響產(chǎn)量和品質(zhì)，嚴重地可造成植株死亡。目前危害較嚴重的病毒種類主要有蘋果莖溝病毒（Apple stem grooving virus，ASGV）、蘋果莖痘病毒（Apple stem pitting virus，ASPV）、蘋果褪綠葉斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV）以及蘋果銹果類病毒屬（Apscaviroid）等[1]。種植無病毒苗木是防治病毒病的最根本途徑，本試驗對課題組優(yōu)選的13個蘋果砧木資源進行病毒脫除處理，并檢測脫毒效果，以期為生產(chǎn)提供更多無病毒蘋果砧木優(yōu)良苗木。

1 材料與方法

1.1 供試材料

課題組保存的蘋果品種及砧木材料：HCT-1、HCT-2、E、M26-1、M26-2、TM7-1、JM7-2、BP、H0、ME-2、W8N13、71-3-150、唐木田共13份材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 脫毒處理方法

于4、5月份大田植株旺盛生長期，取快速生長的新梢，室內(nèi)消毒，在超凈工作臺內(nèi)解剖鏡下剝?nèi)?～2mm的莖尖接種于分化培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)莖尖分化成苗，分化出的植株經(jīng)增殖培養(yǎng)獲得大量繼代苗，將在增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)20d左右的瓶苗放入培養(yǎng)箱進行變溫熱處理，培養(yǎng)條件為38℃光照8h，32℃黑暗下16h，培養(yǎng)40d后切取莖尖于繼代培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，成苗后進行病毒檢測[2]。

1.2.2 病毒檢測

脫毒處理后的組培苗參考郝璐等[3]的方法進行病毒檢測。共檢測 13 個樣品，HCT-1、HCT-2、E、M26-1、M26-2、TM7-1、JM7-2、BP、H0、ME-2、W8N13、71-3-150和唐木田。

檢測方法：共對13個蘋果樣品采樣進行檢測，檢測的病毒為 ASGV、ASPV、ACLSV、Apscaviroid。采用 SiO2吸附法提取RNA，Random Primer進行反轉(zhuǎn)錄。

2 結(jié)果與分析

圖1 內(nèi)參基因及4種病毒、類病毒的電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis of intrinsic reference genes and 4 viruses

由圖1及表1（見下頁）可知，第8、11、13號材料含有ASGV；第2、8、11號材料含有ACLSV；第10號材料含有Apscaviroid。即BP、W8N13、唐木田含有蘋果莖溝病毒；HCT-2、BP、W8N13 含有蘋果褪綠葉斑病毒；ME-2 含有蘋果銹果類病毒；所檢樣品均未檢出蘋果莖痘病毒。蘋果品種E、M26、JM7、H0和71-3-150等砧木通過春季旺盛生長期取材結(jié)合莖尖培養(yǎng)即可脫除所攜帶的病毒，這可能因為春季果樹旺盛生長期新梢的生長速度遠高于病毒繁殖的速度，使得頂芽新梢部位不含病毒或病毒含量極少，再結(jié)合莖尖培養(yǎng)技術(shù)，即可脫除絕大部分病毒。材料HCT莖尖培養(yǎng)獲得再生植株依然攜帶ACLSV，進一步進行高溫處理即可將ACLSV脫除干凈，而唐木田和ME莖尖培養(yǎng)結(jié)合高溫處理仍有部分病毒不能脫除。

表1 供試材料中四種病毒類病毒的攜帶情況Table 1 Portability of four viruses in the test materials

由此可見，取材時期對蘋果病毒的脫除效果影響極大，后期的高溫處理對于病毒的進一步脫除也有一定的貢獻。上述四種病毒，蘋果莖痘病毒相較其他三種病毒更易脫除，而供試材料E、M26、JM7、H0和71-3-150等蘋果砧木更易獲得無病毒植株。

3 結(jié)論

種植無病毒苗木是防治果樹病毒病的最根本途徑，本試驗對課題組現(xiàn)有蘋果砧木資源進行病毒脫除并檢測脫毒效果，結(jié)果顯示，使用RT-PCR檢測脫毒處理后樣品 BP、W8N13、唐木田含有 ASGV；HCT-2、BP、W8N13 含有ACLSV；ME-2含有Apscaviroid；所檢樣品均未檢出ASPV。試驗獲得5份無病毒蘋果砧木組培苗。此外，試驗還得出，蘋果莖痘病毒相較其他三種病毒更易脫除，而供試材料E、M26、JM7、H0和71-3-150等蘋果砧木更易獲得無病毒植株。