趙沙沙 潘高峰 陳 波 房振兵 潘秀才 田永宏

（襄陽市農(nóng)業(yè)科學院，湖北襄陽 441057）

花藥培養(yǎng)是一種快速獲得單倍體植株的常規(guī)技術(shù)，是產(chǎn)生單倍體植株和創(chuàng)制新的種質(zhì)資源的重要途徑[1-2]。1968 年日本學者新關(guān)（Niizeki）和大野（Oono）首次利用水稻花藥培養(yǎng)技術(shù)獲得了單倍體植株[3]。中國于20 世紀70 年代開始水稻花藥培養(yǎng)研究，在水稻花藥培養(yǎng)技術(shù)體系的構(gòu)建、新的種質(zhì)資源創(chuàng)制、新品種培育上取得了很大的發(fā)展[4]。采用常規(guī)育種方法耗時長、效率低，而水稻花藥培養(yǎng)技術(shù)誘導(dǎo)產(chǎn)生的單倍體，表現(xiàn)出雙親性狀的各種重組類型，通過人工處理或自然加倍，在當代就可以獲得穩(wěn)定的二倍體植株[5]，有效縮短育種周期，提高選擇效率，加快育種進程[6]。將花藥培養(yǎng)技術(shù)與常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合，可以快速改良水稻品質(zhì)、產(chǎn)量、抗病性和生育期等性狀，對新品種培育和水稻生產(chǎn)具有重要意義。

水稻花藥培養(yǎng)再生體系受材料基因型、生理狀態(tài)、培養(yǎng)基組分以及培養(yǎng)條件等多個因素的影響，其中，基因型是影響水稻花藥培養(yǎng)效率最關(guān)鍵的因素[7]。研究表明，不同基因型水稻的花藥培養(yǎng)效率有明顯差異，雙親雜交F1的花培效率一般會介于雙親之間而偏向母本。如果雙親的花培效率高，則雜交F1的效率也會較高[8-9]。因此，可以通過篩選基因型，積累具有較高愈傷組織誘導(dǎo)率或者花培效率的水稻材料，組配優(yōu)異的雜交組合來獲取較大量的再生植株群體[3]。目前，水稻花藥培養(yǎng)仍有一定的難度，尤其是秈稻花藥培養(yǎng)力過低，獲得的花培后代群體較小[10]，這與缺乏花藥培養(yǎng)再生能力高、綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良的水稻材料有很大關(guān)系。從大面積推廣應(yīng)用的水稻品種或具有育種價值的水稻材料中篩選、評價高花藥培養(yǎng)力的水稻基因型作為花藥培養(yǎng)的材料具有現(xiàn)實性和必要性。

本研究選取常規(guī)秈稻、秈粳雜交稻、秈型雜交稻和粳型雜交稻4 種不同類型的水稻材料進行花藥培養(yǎng)，比較它們在花藥培養(yǎng)過程中的的愈傷組織誘導(dǎo)率和花藥培養(yǎng)效果，以期為水稻花培育種提供可以選擇的優(yōu)良基因型。研究對提高水稻花藥培養(yǎng)效果、培育花培新品種以及加速水稻花藥培養(yǎng)愈傷組織在遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料選用的試驗材料共分為4 類：常規(guī)秈稻、秈粳雜交稻、秈型雜交稻和粳型雜交稻，如表1 所示。

表1 不同類型試驗材料

1.2 花藥培養(yǎng)方法

1.2.1 幼穗取材和低溫預(yù)處理試驗在襄陽市農(nóng)業(yè)科學院團山基地進行。田間選擇生長健壯、無病蟲害、處于孕穗期的植株，晴天8：00-10：00 取帶有劍葉和倒二葉的幼穗。外部形態(tài)特征主要表現(xiàn)為：劍葉與倒二葉的葉枕距為8～13cm，苞大而不破，剝開苞葉可見幼穗的穎殼寬度已接近成熟大小，穎殼大多數(shù)呈黃綠色，花絲長度為穎殼的1/3～1/2。對田間選取的幼穗鏡檢時，大多數(shù)花粉發(fā)育處于單核靠邊期（即大孢子發(fā)育晚期），此時花藥形成愈傷組織的能力最強。將帶苞葉幼穗的葉片剪去留葉鞘，用75%的酒精擦拭消毒后用干凈的濕潤紗布包裹，裝入保鮮袋中密封貼上標簽，注明材料名稱和取樣時間等信息，在光照培養(yǎng)箱中8℃條件下進行7～11d的低溫預(yù)處理。

1.2.2 花藥接種用75%的酒精對預(yù)處理后的稻穗表面進行消毒，然后在超凈工作臺上剝除葉鞘，選取合適的帶枝小穗，置于50mL 離心管中，加入75%酒精浸泡1min 后倒掉，用無菌水沖洗1 次，然后加入新配制的3%次氯酸鈉溶液完全浸沒小穗，放在渦旋振蕩儀上振蕩25min，倒掉次氯酸鈉溶液用無菌水沖洗4～5 次，再用無菌濾紙吸干水分。在無菌條件下用剪穎抖藥法將花藥接種至誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基上，每個組培瓶接種100～200 個花藥，在組培瓶上注明接種材料和時間，每個處理3 次重復(fù)。在26～28℃的黑暗條件下培養(yǎng)，接種30～60d 內(nèi)統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.2.3 愈傷組織分化及壯苗將已長出的約1.0～2.0mm、淡黃緊湊的新鮮愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，先暗培養(yǎng)3d，然后在26℃、1000～l500Lx、10～12h/d 光照條件下分化培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)分化后30～40d內(nèi)統(tǒng)計綠苗分化率和白苗分化率。

待綠苗長至高3～5cm 時，將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中生根。培養(yǎng)約7d 后，小苗開始生根，20d 左右小苗根長達1.5～2.5cm，打開瓶蓋煉苗，3d 后洗干凈培養(yǎng)基，移栽到大田進行常規(guī)管理。

1.3 培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基分別按照表2 進行配制，pH 值均為5.7～5.9。

表2 所用培養(yǎng)基配方

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析用Microsoft Excel 整理數(shù)據(jù)，計算愈傷誘導(dǎo)率、綠苗分化率、白苗分化率以及花藥培養(yǎng)力，以確定試驗材料花藥培養(yǎng)力（綠苗產(chǎn)率）的大小。試驗數(shù)據(jù)用SPSS23.0 統(tǒng)計軟件進行單因子方差分析以及相關(guān)性分析。計算公式如下。

愈傷誘導(dǎo)率（%）=誘導(dǎo)出的愈傷組織塊數(shù)/接種總花藥數(shù)×100

綠苗分化率（%）=分化出綠苗的愈傷組織塊數(shù)/接種愈傷組織總塊數(shù)×100

白苗分化率（%）=分化出白苗的愈傷組織塊數(shù)/接種愈傷組織總塊數(shù)×100

花藥培養(yǎng)力（%）=愈傷誘導(dǎo)率×綠苗分化率×100

2 結(jié)果與分析

2.1 常規(guī)秈稻花藥培養(yǎng)效果常規(guī)秈稻的花藥培養(yǎng)效果如表3 所示，其愈傷組織誘導(dǎo)率為0.18%～3.01%，禾香1 號的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，福稻88的愈傷組織誘導(dǎo)率最低，不同材料之間的愈傷組織誘導(dǎo)率存在差異，有些材料間差異達顯著水平。根據(jù)愈傷組織誘導(dǎo)率將不同材料分為容易誘導(dǎo)類、較易誘導(dǎo)類和較難誘導(dǎo)類，禾香1 號和福稻99 的愈傷組織誘導(dǎo)率超過1%，顯著高于其他材料，為容易誘導(dǎo)類；粵禾絲苗和農(nóng)香24 的愈傷組織誘導(dǎo)率超過0.5%，為較易誘導(dǎo)類；黃華占、華占和福稻88 的愈傷組織誘導(dǎo)率低于0.5%，屬于較難誘導(dǎo)類。所有材料誘導(dǎo)出的愈傷組織均未分化出綠苗。

表3 不同秈稻材料花藥培養(yǎng)的愈傷組織誘導(dǎo)率比較

禾香1 號是地方常規(guī)秈型高檔優(yōu)質(zhì)稻品系，米質(zhì)優(yōu)；福稻99 是湖北省近幾年自主選育并通過審定的秈型常規(guī)水稻品種，綜合性狀好，花藥培養(yǎng)又相對容易，是進行水稻花培育種的優(yōu)良親本，可以選擇優(yōu)缺點互補、綜合性狀好的親本與它們配制優(yōu)異的雜交組合進行花藥培養(yǎng)以創(chuàng)建DH（Doubled haploid，即雙單倍體）群體。

2.2 秈型雜交稻花藥培養(yǎng)效果玉晶91 作為親本組配的F1雜交組合的花藥培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)率為0.19%～1.79%，玉晶91/農(nóng)香24 最高，玉晶91/玉針香最低，組合間差異顯著（表4）。組合玉晶91/農(nóng)香24 和玉晶91/鄂中5 號的愈傷組織誘導(dǎo)率均超過1%，顯著高于玉晶91/玉針香，容易誘導(dǎo)出愈傷組織。鄂中5 號/禾香1 號的愈傷組織誘導(dǎo)率為1.38%，也容易誘導(dǎo)出愈傷組織。所有材料誘導(dǎo)出的愈傷組織均未分化出綠苗。

表4 不同秈型雜交稻花藥培養(yǎng)的愈傷組織誘導(dǎo)率比較

以玉晶91 組配的F1雜交組合的愈傷組織誘導(dǎo)率除了玉晶91/玉針香外均較高，表明玉晶91 與某些親本間具有較好的雜種優(yōu)勢和花藥培養(yǎng)配合力，而玉針香的愈傷組織誘導(dǎo)率可能較低，所以配制的F1雜交組合誘導(dǎo)率也較低。以愈傷組織誘導(dǎo)率高的禾香1 號為父本，組合鄂中5 號/禾香1 號誘導(dǎo)率也比較高，表明作為親本之一的愈傷組織誘導(dǎo)率高，F(xiàn)1雜交組合愈傷組織誘導(dǎo)率可能也比較高。

2.3 秈粳雜交稻和粳型雜交稻花藥培養(yǎng)效果水稻含粳稻基因的雜交稻愈傷組織誘導(dǎo)率、綠苗分化率、白苗分化率、花藥培養(yǎng)力如表5 所示。不同基因型愈傷組織誘導(dǎo)率存在差異，香1 號/17J42 的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，可以達到79.59%（圖1-A），組合圣稻18-15//春江041/武運粳24 的愈傷組織誘導(dǎo)率最低，為7.68%。供試材料的綠苗分化率為2.05%～27.03%，組合圣稻18-15//春江041/武運粳24 綠苗分化率最高，為27.03%，其次為甬優(yōu)1526和甬優(yōu)2640，均超過10%。供試材料花藥培養(yǎng)白化現(xiàn)象嚴重，除了組合圣稻18-15//春江041/武運粳24 外，甬優(yōu)2640、甬優(yōu)1526、香1 號/17J42 和中浙粳18/鄂香2 號4 個材料的白苗分化率均高于綠苗分化率。供試材料的花藥培養(yǎng)力為1.40%～3.60%，甬優(yōu)2640 的花藥培養(yǎng)力顯著高于其他材料，中浙粳18/鄂香2 號最低。

表5 水稻粳型材料花藥培養(yǎng)效果比較

總的來看，甬優(yōu)1526 形成的白苗分化率較高，組合圣稻18-15//春江041/武運粳24 的愈傷組織誘導(dǎo)率較低，中浙粳18/鄂香2 號和香1 號/17J42雖然容易誘導(dǎo)愈傷組織，但形成的愈傷組織質(zhì)量很差，綠苗分化率較低，以上均不適合作為水稻花藥培養(yǎng)育種的材料。甬優(yōu)2640 的愈傷組織誘導(dǎo)率和綠苗分化率均較高，可以作為水稻花藥培養(yǎng)育種的材料（圖1-B，C，D）。

圖1 部分水稻粳型材料花藥培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)和分化情況

相關(guān)分析表明，供試材料的愈傷組織誘導(dǎo)率、綠苗分化率、白苗分化率和花藥培養(yǎng)力兩兩之間相關(guān)不顯著。

3 結(jié)論與討論

本研究對4 種不同類型的水稻進行花藥培養(yǎng)，結(jié)果表明花藥培養(yǎng)效果在基因型間有顯著差異，與前人研究結(jié)果大致相同。常規(guī)秈稻禾香1 號和福稻99 愈傷組織誘導(dǎo)率高，可作為水稻花培育種的優(yōu)良親本。以玉晶91 為親本配制雜交組合并進行花藥培養(yǎng)，結(jié)果表明玉晶91 與某些親本間具有較好的雜種優(yōu)勢和花藥培養(yǎng)配合力，在水稻花培育種中具有一定的潛在利用價值。禾香1 號愈傷組織誘導(dǎo)率高，組合鄂中5 號/禾香1 號也較高，表明作為親本之一的愈傷組織誘導(dǎo)率高，F(xiàn)1雜交組合愈傷組織誘導(dǎo)率可能也比較高。含粳稻血緣的雜交稻中，甬優(yōu)1526、圣稻18-15//春江041/武運粳24、中浙粳18/鄂香2 號和香1 號/17J42 均不適合作為水稻花藥培養(yǎng)育種的材料。甬優(yōu)2640 的花藥培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)率和綠苗分化率均較高，可以在水稻花培育種和DH 群體創(chuàng)建中加以利用。相關(guān)性分析表明，供試材料的愈傷組織誘導(dǎo)率、綠苗分化率、白苗分化率和花藥培養(yǎng)力兩兩之間相關(guān)不顯著。

水稻材料（即基因型）對水稻花藥培養(yǎng)效果的影響最重要。一般認為，花藥培養(yǎng)力的大小為糯稻>粳稻>秈粳雜交稻>秈型雜交稻>秈稻，同一類型的不同品種之間差異也較大[11]。目前花培育種常用的方法是在綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良的水稻品種（系）中，篩選出較高培養(yǎng)力的水稻材料配制優(yōu)異的雜交組合來進行花藥培養(yǎng)。

供試水稻材料在花藥培養(yǎng)過程中白化現(xiàn)象嚴重，大部分材料的再生白苗均比再生綠苗要多。可能受到取材時期、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件等因素的影響，在愈傷組織分化階段通常會產(chǎn)生大量的白化苗。已有不少報道表明，花藥的生長狀態(tài)和培養(yǎng)條件均可以影響白化苗的產(chǎn)生。在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，適當降低錳的含量和無機鹽濃度，2，4-D、KT 或者NAA 的激素配比要適量[12]，既能提高愈傷組織誘導(dǎo)率，同時又能降低白苗分化率。在愈傷組織誘導(dǎo)和分化階段，在不影響正常生長的前提下降低溫度，減少光照也可以降低白苗分化率[12]。

開展水稻花藥培養(yǎng)育種工作對親本選配具有很高要求，不僅要求雙親品質(zhì)優(yōu)良、產(chǎn)量高、抗病性強、優(yōu)缺點互補，而且雙親之一要具有較高的愈傷組織誘導(dǎo)率或者花藥培養(yǎng)配合力，這是提高水稻花培育種效率的關(guān)鍵。影響水稻花藥培養(yǎng)效率最重要的因素是基因型。秈稻花藥培養(yǎng)力一般偏低，愈傷組織誘導(dǎo)率只有0.5%，一般不超過5%，有些材料甚至不能誘導(dǎo)出愈傷組織[13]。為了提高秈稻花藥培養(yǎng)效率，可以通過篩選基因型，積累花藥培養(yǎng)力高的水稻材料，然后與另一個綜合性狀優(yōu)良的親本配制雜交組合進行花藥培養(yǎng)來獲取較大量的花培后代群體。還可以把花藥培養(yǎng)力高的基因通過雜交、回交等手段導(dǎo)入到優(yōu)良親本或者雜交材料中，改善花藥培養(yǎng)的遺傳背景來獲取較大量的單倍體植株[11]。因此，從大面積推廣應(yīng)用的水稻品種或具有育種價值的水稻材料中篩選、評價高花藥培養(yǎng)力的水稻基因型作為花藥培養(yǎng)育種的材料，對新的種質(zhì)資源創(chuàng)制、DH 群體構(gòu)建和進行花培育種具有十分重要的意義。