王斌 張志敏 王東 金豐 毛萬里 朱文彥 王閣

前列腺癌是男性最常見的惡性腫瘤之一，隨著我國人口老齡化，前列腺癌的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢[1-2]。對于侵襲性及復(fù)發(fā)性的前列腺癌，目前尚無有效治療方法，尋找新的前列腺癌的藥物治療靶點(diǎn)一直是國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)[3]。微小RNA(microRNA，miRNA)屬于內(nèi)源性非編碼小RNA，通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等細(xì)胞生物學(xué)行為，在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4]。研究miRNA調(diào)控腫瘤細(xì)胞的分子機(jī)制可能為臨床診斷和治療腫瘤提供更好的策略。miR-142-5p在許多腫瘤研究中都有報(bào)道，如結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、腎癌等[5-7]，但在前列腺癌中的報(bào)道較少。本研究旨在觀察miR-142-5p對前列腺癌細(xì)胞增殖與侵襲的影響，并通過生物信息學(xué)預(yù)測及雙熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)探究miR-142-5p的作用機(jī)制。

材料與方法

一、材料

人前列腺癌細(xì)胞系LNCaP購于上海信然生物技術(shù)有限公司；胎牛血清購于杭州四季青生物公司；DMEM培養(yǎng)液購于美國Hyclone公司；Lipofectamine?3000購于美國Invitrogen公司；miR-142-5p模擬物、對照序列miR-NC和PCR引物購于上海吉瑪公司；實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)試劑盒購于日本TaKaRa公司；細(xì)胞周期檢測試劑盒購自上海碧云天公司；噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒購于美國Sigma公司；Transwell小室購于美國Corning公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)試劑盒購于美國Promega公司；野生型與突變型TOP2A熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒(pGL-4載體)由南京諾唯贊生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成；Matrigel基質(zhì)膠和一抗TOP2A、Cyclin E1、CDK2、β-catenin、Vimentin和GAPDH購于美國BD公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購于美國Abcam公司；超敏ECL發(fā)光試劑盒購于美國Thermo公司。

二、細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

采用DMEM培養(yǎng)液加10%胎牛血清于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)人前列腺癌細(xì)胞系LNCaP。轉(zhuǎn)染前1 d，將處于對數(shù)生長期的LNCaP細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種3×105個(gè)，按照Lipofectamine?3000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為2組：對照組(轉(zhuǎn)染miR-NC)和實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染miR-142-5p模擬物)，8 h 后觀察細(xì)胞狀態(tài)并更換新鮮DMEM培養(yǎng)液。

三、qPCR檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中miR-142-5p和TOP2A的表達(dá)量

采用Trizol法提取細(xì)胞中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。分別用miR-142-5p和TOP2A引物通過PCR儀擴(kuò)增檢測細(xì)胞中miR-142-5p和TOP2A的表達(dá)，以U6和GAPDH作參照。按照qPCR試劑盒說明書建立反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性5 s，65 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次，結(jié)果用2-ΔΔCt值表示。miR-142-5p上游引物：5′-GGATCATAAAGTAGAAAGCA-3′，下游引物5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；TOP2A上游引物：5′-ACCATTGCAGCCTGTAAATGA-3′，下游引物5′-GGGCGGAGCAAAATATGTTCC-3′；GAPDH上游引物：5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游引物5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。

四、流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期

收集各組細(xì)胞，PBS溶液洗滌2次，加入70%乙醇4 ℃下固定過夜。PBS溶液洗滌2次，加入Rnase A和溴化丙啶染液，4 ℃避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

五、MTT法檢測細(xì)胞增殖能力

收集各組細(xì)胞，按3 000個(gè)/孔接種于96孔板，共接種5塊培養(yǎng)板，每孔加200 μl培養(yǎng)液。在每個(gè)測量點(diǎn)，每孔中分別加入15 μl 5 mg/ml的MTT試劑，37 ℃再培養(yǎng)4 h后吸去培養(yǎng)液，每孔加入150 μl二甲基亞砜，搖床振蕩溶解結(jié)晶，用酶標(biāo)儀檢測每孔在波長490 nm處的吸光度(A)值。分別檢測培養(yǎng)第1、2、3、4、5天的細(xì)胞增殖能力。

六、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力

用無血清DMEM培養(yǎng)液按5∶1稀釋Matrigel基質(zhì)膠，均勻鋪于Transwell小室，37 ℃凝固4 h。將處于對數(shù)生長期的2組細(xì)胞消化后，用無血清DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×105個(gè)/ml，在Transwell小室內(nèi)加入200 μl細(xì)胞懸液，在Transwell小室外加入600 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。連續(xù)培養(yǎng)24 h后，棉簽擦去上層細(xì)胞，甲醇室溫固定20 min，結(jié)晶紫染色,室溫染色20 min，清水沖洗、晾干。顯微鏡下每孔隨機(jī)取4個(gè)視野計(jì)數(shù)，取平均數(shù)。

七、生物信息學(xué)預(yù)測和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-142-5p的靶基因

結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測軟件TargetScan、miRecords及miRWalk的分析，預(yù)測miR-142-5p的靶基因。將野生型TOP2A質(zhì)粒命名為TOP2A 3′ UTR-WT，將突變型TOP2A質(zhì)粒命名為TOP2A 3′ UTR-MUT。將處于對數(shù)生長期的LNCaP細(xì)胞接種至24孔板，待孔內(nèi)細(xì)胞密度達(dá)60%，將miR-142-5p模擬物或miR-NC分別與TOP2A 3′ UTR-WT或TOP2A 3′ UTR-MUT質(zhì)粒用Lipofectamine?3000共同轉(zhuǎn)染至LNCaP細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)試劑盒說明書檢測各組細(xì)胞熒光活性，以螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶活性的比值反映各組細(xì)胞的相對熒光素酶活性。

八、免疫印跡法(Western blot)檢測靶基因的表達(dá)

收集細(xì)胞，加入蛋白裂解液裂解，提取總蛋白。加入等量蛋白樣品，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%封閉液室溫封閉2 h，4 ℃過夜孵育TOP2A、Cyclin E1、CDK2、β-catenin、Vimentin和GAPDH一抗(稀釋比均為1∶1 000)。加入相應(yīng)二抗，室溫下孵育2 h。滴加超敏ECL發(fā)光試劑顯色，凝膠成像儀拍照。

九、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、LNCaP細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-142-5p的效率

qPCR檢測結(jié)果顯示(圖1)，實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞中miR-142-5p的表達(dá)量分別為(9.20±0.76)和(1.03±0.13)，實(shí)驗(yàn)組miR-142-5p的表達(dá)量是對照組的8.93倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 實(shí)驗(yàn)組和對照組LNCaP細(xì)胞中miR-142-5p的表達(dá)量(與對照組比較bP<0.01)

二、LNCaP細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-142-5p對細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)(圖2)，與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組處于G0/G1期的細(xì)胞數(shù)量明顯增加，而處于S期的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明miR-142-5p一定程度上抑制前列腺癌細(xì)胞LNCaP從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)變。

圖2 miR-142-5p對LNCaP細(xì)胞周期的影響(與對照組比較aP<0.01，bP<0.01)

三、LNCaP細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-142-5p對細(xì)胞增殖的影響

MTT檢測結(jié)果顯示(圖3)，實(shí)驗(yàn)組LNCaP細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后第4、5天的A值低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.04，P=0.004)，表明miR-142-5p一定程度上抑制前列腺癌細(xì)胞LNCaP的增殖。在第1、2、3天的A值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖3 實(shí)驗(yàn)組和對照組LNCaP細(xì)胞增殖能力比較(與對照組比較aP<0.05，bP<0.01)

四、LNCaP細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-142-5p對細(xì)胞侵襲的影響

如圖4所示，實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞中穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(72.83±10.76)和(158.30±19.71)個(gè)。與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，miR-142-5p一定程度上抑制前列腺癌細(xì)胞LNCaP的侵襲。

圖4 實(shí)驗(yàn)組和對照組LNCaP細(xì)胞侵襲能力比較(與對照組相比bP<0.01)

五、生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果

結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測軟件TargetScan、miRecords及miRWalk的分析，預(yù)測miR-142-5p的靶基因?yàn)門OP2A，具體的結(jié)合序列見圖5。

圖5 miR-142-5p與TOP2A 3′-UTR互補(bǔ)結(jié)合的序列

六、miR-142-5p與TOP2A的靶向結(jié)合驗(yàn)證

與TOP2A 3′ UTR-WT相比，TOP2A 3′ UTR-MUT由序列“ACUUUAU”突變?yōu)椤癠GAAAUA”。將miR-142-5p模擬物或miR-NC分別與TOP2A 3′ UTR-WT或TOP2A 3′ UTR-MUT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至LNCaP細(xì)胞中，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)檢測相對熒光素酶活性，以檢驗(yàn)miR-142-5p與TOP2A的靶向結(jié)合。如圖6所示，miR-142-5p可明顯抑制TOP2A 3′ UTR-WT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的相對熒光素酶活性，而對TOP2A 3′ UTR-MUT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的相對熒光素酶活性無影響，表明miR-142-5p可靶向結(jié)合TOP2A基因。

七、LNCaP細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-142-5p對TOP2AmRNA表達(dá)的影響

qPCR檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后實(shí)驗(yàn)組LNCaP細(xì)胞中TOP2A mRNA的表達(dá)量(0.26±0.08)顯著低于對照組(1.00±0.07)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

八、Western blot檢測TOP2A蛋白的表達(dá)

為進(jìn)一步探討miR-142-5p在LNCaP細(xì)胞中的作用機(jī)制，采用Western blot檢測轉(zhuǎn)染miR-142-5p模擬物48 h后TOP2A蛋白、細(xì)胞周期相關(guān)蛋白、細(xì)胞侵襲性相關(guān)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組TOP2A表達(dá)水平降低，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白如Cyclin E1、CDK2表達(dá)降低，細(xì)胞侵襲性相關(guān)蛋白β-catenin表達(dá)升高，Vimentin蛋白表達(dá)降低(圖7)。

1：miR-142-5p+TOP2A 3′ UTR-MUT；2：miR-142-5p+TOP2A 3′ UTR-WT；3：miR-NC+TOP2A 3′ UTR-MUT；4：miR-NC+TOP2A 3′ UTR-WT

圖6 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-142-5p與TOP2A的靶向結(jié)合(與1相比bP<0.01)

圖7 轉(zhuǎn)染miR-142-5p模擬物對TOP2A蛋白及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

討 論

研究前列腺癌增殖和侵襲的機(jī)制對前列腺癌患者的靶向藥物治療具有重要意義[8]。miRNA是一種長約19～25個(gè)核苷酸的小分子單鏈RNA，可與靶基因mRNA的3′非編碼區(qū)配對結(jié)合，引起靶基因mRNA的降解或者抑制其翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平干擾基因的表達(dá)[9-10]。目前，已有多種miRNA如miR-136、miR-181c、miR-204被證明與前列腺癌的形成相關(guān)[11-13]。越來越多的研究顯示，miR-142-5p與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)[14-16]。Wang等[7]研究發(fā)現(xiàn)miR-142-5p在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)顯著下調(diào)，miR-142-5p過表達(dá)可在體內(nèi)外顯著抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖。Lou等[15]發(fā)現(xiàn)miR-142-5p過表達(dá)通過抑制肝癌細(xì)胞的生長和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在肝癌中表現(xiàn)為重要的抑癌基因作用。Qin等[16]研究表明，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中，miR-142-5p的表達(dá)顯著下調(diào)，miR-142-5p的過表達(dá)可顯著抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤的遷移和侵襲。以上結(jié)果表明miR-142-5p可能在惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌作用，但miR-142-5p在前列腺癌中的報(bào)道較少。

我們利用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法，在前列腺癌細(xì)胞LNCaP中過表達(dá)miR-142-5p，探討miR-142-5p對前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。結(jié)果表明過表達(dá)miR-142-5p的LNCaP細(xì)胞較對照組增殖和侵襲能力明顯受到抑制，表明miR-142-5p可能在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮抑癌作用。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明miR-142-5p可阻滯LNCaP細(xì)胞G0/G1期向S期的轉(zhuǎn)換，這可能是miR-142-5p抑制前列腺癌細(xì)胞增殖的主要原因。本研究首先通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)TOP2A是miR-142-5p的靶基因。TOP2A基因位于17q12染色體，在染色體結(jié)構(gòu)的保持、染色體分離、DNA復(fù)制等生物學(xué)過程中起重要作用[17]。近年來的研究表明，TOP2A的基因表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，已發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、胃癌、前列腺癌等多種腫瘤中有高表達(dá)的傾向，與腫瘤的惡性生物學(xué)行為及患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)[17-19]。TOP2A在前列腺癌特別是侵襲性較高的前列腺癌中呈現(xiàn)高表達(dá)[19]。TOP2A可能成為前列腺癌患者的藥物治療靶點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-142-5p可直接結(jié)合TOP2A 3′ UTR。本研究顯示，當(dāng)miR-142-5p過表達(dá)可下調(diào)TOP2A的蛋白水平。TOP2A蛋白下調(diào)后，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白如Cyclin E1、CDK2表達(dá)降低，表明細(xì)胞周期受到顯著阻滯。細(xì)胞侵襲性相關(guān)蛋白β-catenin表達(dá)升高，Vimentin蛋白表達(dá)降低，表明細(xì)胞侵襲性下降。miR-142-5p對前列腺癌細(xì)胞增殖和侵襲的調(diào)控可能是通過抑制TOP2A蛋白實(shí)現(xiàn)的。本研究的不足之處在于沒有檢測臨床前列腺癌組織標(biāo)本中miR-142-5p的表達(dá)量，我們下一步將通過收集臨床前列腺癌組織標(biāo)本和患者臨床隨訪信息，探討miR-142-5p與前列腺癌患者診療、預(yù)后的相關(guān)性。

總之，本研究結(jié)果表明，miR-142-5p與TOP2A存在靶向關(guān)系，miR-142-5p可通過靶向調(diào)控TOP2A，阻滯前列腺癌細(xì)胞LNCaP的細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞的增殖與侵襲，說明miR-142-5p在前列腺癌中為抑癌基因，有望在前列腺癌的分子治療中發(fā)揮特異性作用。