郭永連 周四維 周海洪 李國灝 余家俊

組織細(xì)胞的生長和發(fā)育依賴于組織內(nèi)細(xì)胞生存和死亡的有序調(diào)控，信號分子磷酸化水平的變化是調(diào)控各種信號通路活化狀態(tài)的重要方式。惡性腫瘤的生長優(yōu)勢源于細(xì)胞內(nèi)凋亡信號的弱化和生存信號的失控性放大。作為第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的具有雙重特異性磷酸酶活性的抑癌基因蛋白，PTEN的功能變化對腫瘤細(xì)胞的信號調(diào)節(jié)及生物學(xué)行為具有重要的影響[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌標(biāo)本及細(xì)胞株中有PTEN的突變及表達(dá)降低[3]， PTEN的表達(dá)水平與尿路上皮癌的臨床分期和病理分級密切相關(guān)[4]。本研究利用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將野生型PTEN基因(WT-PTEN)與兩種突變型PTEN基因，即G129E-PTEN(無脂質(zhì)磷酸酶活性而保留蛋白磷酸酶活性)和C124A-PTEN(喪失磷酸酶活性)分別導(dǎo)入人膀胱癌細(xì)胞株BIU-87中，觀察細(xì)胞內(nèi)焦點(diǎn)黏附激酶(focal adhesion kinase, FAK)、蛋白激酶B(protein kinase B, PKB/Akt)磷酸化水平的變化及其對膀胱癌細(xì)胞株BIU-87凋亡及細(xì)胞周期的影響，初步探討PTEN對膀胱尿路上皮癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響及機(jī)制。

材料與方法

一、材料與試劑

人膀胱癌細(xì)胞BIU-87(購自武漢大學(xué)典型生物保藏中心)；小牛血清和RPMI 1640培養(yǎng)液(購自美國Hyclone公司)；兔抗PTEN多克隆抗體(購自美國Labvision公司)；一抗兔抗人β-actin、二抗HRP標(biāo)記羊抗兔、羊抗鼠IgG、化學(xué)發(fā)光(ECL)底物(購自Santa Cruz公司)；鼠抗磷酸化FAK(Tyr-397)單克隆抗體、兔抗磷酸化Akt(Ser-473)多克隆抗體(購自美國CST公司)；攜帶野生型PTEN、G129E-PTEN和C124A-PTEN的GFP表達(dá)質(zhì)粒pGZ21&xZ(pGZ21&xZ為5 400 bp,PTEN為1 300 bp)(美國Kenneth M. Yamada教授惠贈(zèng)[5])。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：BIU-87細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中(青霉素100 IU/ml,鏈霉素100 mg/L)，于37 ℃、5% CO2溫箱中培養(yǎng)。采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法，將4種質(zhì)粒分別導(dǎo)入處于對數(shù)生長期的BIU-87細(xì)胞中，4種轉(zhuǎn)染細(xì)胞分別用WT-PT/87、G129E-PT/87、C124A-PT/87 及GFP/87 表示。繼續(xù)在上述條件下培養(yǎng)，待用。

2.Western blot 檢測蛋白表達(dá)：細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白， Braford法測定蛋白質(zhì)濃度。取等量(50 μg)細(xì)胞總蛋白行SDS-PAGE凝膠恒壓電泳，電泳轉(zhuǎn)膜后取相應(yīng)一抗(兔抗PTEN 1∶200)、鼠抗磷酸化FAK(Tyr-397)、兔抗磷酸化Akt (1∶1 000) 4 ℃溫育過夜，漂洗后與相應(yīng)二抗室溫下溫育2 h， ECL顯影成像，膠片經(jīng)英國UVP公司GDS8000型凝膠成像分析系統(tǒng)處理數(shù)據(jù)，計(jì)算灰度值。以β-actin蛋白作為內(nèi)參。

3.細(xì)胞凋亡分析：細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，Annexin V/PI法染色，采用激光共聚焦顯微鏡技術(shù)(Leica,美國BD公司) 觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)，并采用FACSort流式細(xì)胞儀(美國BD公司)檢測細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用ModFit軟件進(jìn)行分析，采用SPSS 10.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)和Pearson’s相關(guān)檢驗(yàn)。

結(jié) 果

一、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及PTEN表達(dá)的鑒定

轉(zhuǎn)染后48 h，熒光顯微鏡下觀察4種轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率均達(dá)到76%～89%(圖1)。Western blot結(jié)果顯示, 與對照BIU-87細(xì)胞相比，WT-PT/87(t=21.34，P<0.01)、G129E-PT/87(t=25.50，P<0.01)和C124A-PT/87(t=23.47，P<0.01)中的PTEN表達(dá)增強(qiáng)了210%～260%, 而GFP/87細(xì)胞中的PTEN表達(dá)無明顯變化(圖2)。

A:GFP/87;B:C124A-PT/87;C:G129E-PT/87;D:WT-PT/87

圖1 轉(zhuǎn)染48 h后質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率

二、PTEN表達(dá)對細(xì)胞內(nèi)FAK、Akt蛋白表達(dá)及其磷酸化水平的影響

與對照細(xì)胞比較，WT-PT/87細(xì)胞內(nèi)磷酸化FAK (p-FAK)和磷酸化Akt(p-Akt)水平分別下降59%(P<0.01)和89%(P<0.01)；G129E-PT/87細(xì)胞內(nèi)p-FAK和p-Akt水平分別下降62%(P<0.01)和46%(P<0.05)；而C124A-PT/87和GFP/87細(xì)胞內(nèi)FAK和Akt的磷酸化水平無明顯降低(圖2) 。

圖2 不同組細(xì)胞PTEN、p-FAK和p-AKT的表達(dá)

三、細(xì)胞凋亡分析

共聚集顯微鏡下轉(zhuǎn)染細(xì)胞胞質(zhì)呈GFP(530 nm)綠色熒光，胞核為PI(560 nm)染色紅色，凋亡細(xì)胞可見染色體邊集、核濃縮、核碎裂等典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變(圖3)。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，WT-PT/87與G129E-PT/87細(xì)胞凋亡率分別為(18.5±2.1)% (t=17.34,P<0.01)和(10.1±0.5)% (t=14.58,P<0.01)，明顯高于對照細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而C124A-PT/87與 GFP/87細(xì)胞凋亡率無明顯升高(圖4、表1)。各種細(xì)胞Akt磷酸化水平與凋亡率變化呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-1.145,P<0.01)。

Ⅰ:GFP(530 nm)細(xì)胞質(zhì)呈綠色熒光；Ⅱ：PI(560 nm)細(xì)胞核呈紅色；Ⅲ：凋亡細(xì)胞可見核染色體邊集、核濃縮、核碎裂等典型凋亡形態(tài)學(xué)改變(→所示)

圖3 共聚焦顯微鏡下轉(zhuǎn)染細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

圖4 轉(zhuǎn)染及對照細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期

表1 轉(zhuǎn)染及對照細(xì)胞凋亡率(%)與細(xì)胞周期±s)

與BIU-87細(xì)胞比較★t=17.34,P<0.01；※t=14.58,P<0.01; 與G129E-PT/87細(xì)胞比較#t=10.34,P<0.01

討 論

PTEN/MMAC1/TEP1是一個(gè)抑癌基因，位于染色體10q23.3，具有雙重磷酸酶活性：既可作為脂質(zhì)磷酸酶使磷酸肌醇3,4,5三磷酸(PIP3)的D3位脫磷酸，負(fù)性調(diào)控PI3K/Akt通路，調(diào)控細(xì)胞G1期阻滯和細(xì)胞凋亡；也可作為蛋白磷酸脂酶，使磷酸酪氨酸、磷酸絲/蘇氨酸去磷酸，通過分子信號的級鏈放大效應(yīng)抑制MAPK信號通路[1,6]。在多種晚期惡性腫瘤組織(如非小細(xì)胞肺癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、前列腺癌和甲狀腺癌)中存在著PTEN基因不同程度的突變或丟失，它是人類腫瘤中突變率最高的基因之一[7]。研究發(fā)現(xiàn), 膀胱癌標(biāo)本及細(xì)胞株中有PTEN的突變及表達(dá)降低[3]， PTEN表達(dá)水平與尿路上皮癌的臨床分期和病理分級密切相關(guān)[4]。文獻(xiàn)報(bào)道PTEN的突變或失活可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)多個(gè)信號通路活性的改變，并且導(dǎo)入外源性PTEN可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，但其具體機(jī)制尚未完全明確[8]。

本研究通過檢測細(xì)胞內(nèi)兩個(gè)重要的信號分子FAK和Akt，探討PTEN對相關(guān)信號通路的作用機(jī)制。FAK是整合蛋白介導(dǎo)信號通路的關(guān)鍵分子，整合蛋白的簇集引起FAK的自動(dòng)磷酸化和聚集，與PI3K結(jié)合而使其激活，其活化后可結(jié)合p130cas、Grb2、PI3K等調(diào)控細(xì)胞的黏附、遷移和增殖等行為。同時(shí)FAK也直接激活A(yù)kt，從而激發(fā)PI3K/Akt通路[9]。我們將外源性PTEN導(dǎo)入BIU-87細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-PTEN和僅保留蛋白磷酸酶活性的G129E-PTEN后，胞內(nèi)FAK磷酸化水平下降了59%和62%，這說明至少在BIU-87細(xì)胞中PTEN主要通過其蛋白磷酸酶活性使FAK去磷酸化。Akt是PI3K/PIP3通路的關(guān)鍵下游分子，活化的Akt可經(jīng)多種途徑刺激腫瘤細(xì)胞逃避凋亡，異常增殖[10]，因此，PTEN對PIP3的去磷酸化作用可能會(huì)抑制Akt的磷酸化而影響細(xì)胞的生物學(xué)行為。本實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-PTEN的BIU-87細(xì)胞內(nèi) p-Akt的表達(dá)明顯降低，這一結(jié)果與國外相關(guān)研究報(bào)道一致[11]。但我們發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染G129E-PTEN的細(xì)胞中p-Akt水平也下降了46%，而轉(zhuǎn)染無磷酸酶活性的C124A-PTEN后，其胞內(nèi)FAK、Akt磷酸化水平均無變化，說明PTEN蛋白磷酸酶活性也對Akt磷酸化有一定的抑制作用。由于缺失脂質(zhì)磷酸酶活性的PTEN并不能直接調(diào)節(jié)PI3K/Akt，因此，這一作用可能是通過PTEN使FAK去磷酸化，抑制FAK與PI3K的結(jié)合所實(shí)現(xiàn)的，這也提示了PTEN調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號通路網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性和復(fù)雜性。

細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，WT-PT/87和G129E/87細(xì)胞的凋亡率分別上升了(18.5±2.1)%和(10.1±0.5)%，表明PTEN可誘導(dǎo)BIU-87細(xì)胞發(fā)生凋亡。兩種細(xì)胞內(nèi)FAK磷酸化水平無明顯差異，Akt磷酸化水平和細(xì)胞凋亡率的變化呈明顯負(fù)相關(guān)，提示這種作用很可能是通過其脂質(zhì)酶活性抑制Akt的磷酸化而實(shí)現(xiàn)。

本研究通過將外源性PETN及其突變體導(dǎo)入膀胱尿路上皮癌細(xì)胞BIU-87證實(shí)，提高PTEN表達(dá)水平能促進(jìn)膀胱腫瘤細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與其脂質(zhì)酶活性降低Akt磷酸化水平相關(guān)，PTEN蛋白磷酸酶活性可能通過調(diào)節(jié)FAK磷酸化水平參與調(diào)節(jié)Akt磷酸化。本研究為PTEN用于膀胱癌的生物治療提供了一定的理論基礎(chǔ)，仍需更多的細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以進(jìn)一步研究和探討。