段哲萍,于新江,張 卉,吳大勇,李菁菁

(1. 河北省人民醫(yī)院,河北 石家莊 050051；2. 河北醫(yī)科大學(xué)，河北 石家莊 050017)

疼痛是晚期惡性腫瘤患者的常見癥狀，臨床上應(yīng)用非甾體抗炎藥，曲馬多、嗎啡，羥考酮、芬太尼等三階梯止痛藥可以有效控制癌痛，但三階梯止痛藥物有劑量依賴性、成癮依賴性(指藥物與機(jī)體相互作用所造成的一種精神狀態(tài)及身體狀態(tài)，患者表現(xiàn)出一種強(qiáng)迫性連續(xù)定期用該藥的行為，目的是要去感受藥物的精神效應(yīng)，或是為了避免由于斷藥所引起的不舒適)，且強(qiáng)阿片類藥物有嚴(yán)重的毒副作用如惡心、嘔吐、反酸、慢性胃炎、便秘、尿潴留、嗜睡、頭暈、認(rèn)知能力下降、呼吸抑制、體位性低血壓等[1-4]，故尋求鎮(zhèn)痛效果穩(wěn)定而軀體及精神依賴性小、安全性高的藥物是目前研究的熱點(diǎn)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，鼠婦提取物具有明顯鎮(zhèn)痛作用，可用于各類疼痛的治療，但其機(jī)制尚不十分明確[5-7]。本研究探討了鼠婦乙酸乙酯提取物的鎮(zhèn)痛作用、成癮性及相關(guān)作用機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥品 體質(zhì)量20 g左右的清潔級(jí)昆明小鼠120只，雌雄各半，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):scxk(桂)20170002。鼠婦乙酸乙酯提取物由河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院制備、鑒定、濃度測定，李愛英教授贈(zèng)送。冰醋酸(北京精細(xì)化學(xué)用品有限責(zé)任公司)，嗎啡注射液(華北制藥廠，10 mg/支)，鹽酸納洛酮(北京四環(huán)醫(yī)藥股份有限公司，0.4 mg /支)，生理鹽水(北京四環(huán)醫(yī)藥股份有限公司)，環(huán)氧化物水解酶(COX)試劑盒(Cayman公司，美國)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1冰醋酸誘發(fā)小鼠扭體法鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn) 隨機(jī)取上述昆明小鼠40只，雌雄各半，禁食12 h后隨機(jī)分為4組，每組10只。生理鹽水組小鼠給予皮下注射生理鹽水10 mL/kg，鼠婦低、中、高劑量組小鼠分別皮下注射鼠婦乙酸乙酯提取物50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg(參考文獻(xiàn)[6]確定給藥劑量)，干預(yù)30 min后，每只小鼠腹腔注射1.0%冰醋酸10 mL/kg致痛，觀察記錄20 min內(nèi)每只小鼠產(chǎn)生扭體反應(yīng)的次數(shù)，并計(jì)算扭體反應(yīng)抑制率。扭體反應(yīng)抑制率=(對(duì)照組扭體反應(yīng)次數(shù)均數(shù)-給藥組扭體反應(yīng)次數(shù)均數(shù))/給藥組扭體反應(yīng)次數(shù)均數(shù)×100%。

1.2.2嗎啡刺激小鼠S形豎尾成癮性實(shí)驗(yàn) 隨機(jī)取上述昆明小鼠40只，雌雄各半，禁食12 h后隨機(jī)分為嗎啡組和鼠婦低、中、高劑量組，每組10只。4組小鼠均給予皮下注射嗎啡注射液15 mg/kg(參考文獻(xiàn)[6]確定給藥劑量)，鼠婦低、中、高劑量組小鼠注射嗎啡后分別皮下注射鼠婦乙酸乙酯提取物50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg，均1次/d,連續(xù)注射15 d，每日給藥后15 min記錄各組小鼠S形豎尾反應(yīng)情況。

1.2.3納洛酮催癮小鼠跳躍成癮性實(shí)驗(yàn) 取剩余40只小鼠，禁食12 h后隨機(jī)分為嗎啡組和鼠婦低、中、高劑量組，每組10只。4組小鼠均給予皮下注射嗎啡注射液100 mg/kg(參考文獻(xiàn)[7]確定給藥劑量，使小鼠成癮)，鼠婦低、中、高劑量組小鼠注射嗎啡后分別皮下注射鼠婦乙酸乙酯提取物50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg，均每12 h 1次，連續(xù)7 d，注射結(jié)束后6 h，每組小鼠均給予皮下注射納洛酮注射液5 mg/kg催癮，隨即將小鼠放于圓形實(shí)驗(yàn)臺(tái)上(高30 cm，直徑30 cm)，記錄30 min內(nèi)每組跳躍小鼠數(shù)。

1.2.4鼠婦乙酸乙酯提取物對(duì)COX酶的抑制實(shí)驗(yàn)根據(jù)COX酶試劑盒的具體實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作。取96孔板，分成8組，每組3孔。每孔中均加入160 μL緩沖液、10 μL血紅素液、10 μL DMSO。設(shè)置空白對(duì)照組；陽性對(duì)照組再加入10 μL COX酶溶液；各給藥組除加入10 μL COX酶溶液外，再分別加入10 μL不同濃度的鼠婦乙酸乙酯提取物(7.5 ng/mL、15 ng/mL、30 ng/mL、60 ng/mL、120 ng/mL、240 ng/mL)；8組均加入20 μL顯色劑及20 μL酸劑，混勻，放置5 min后于酶聯(lián)免疫檢測儀590 nm處測定吸光值并記錄，計(jì)算抑制率。抑制率=[1-(給藥組吸光值均數(shù)-空白組吸光值均數(shù))/(對(duì)照組吸光值均數(shù)-空白組吸光值均數(shù))]×100%。

2 結(jié) 果

2.1各組冰醋酸誘發(fā)小鼠扭體反應(yīng)情況 鼠婦各劑量組小鼠扭體次數(shù)均明顯少于生理鹽水組(P均<0.05)。鼠婦各劑量組的扭體反應(yīng)抑制率隨鼠婦乙酸乙酯提取物劑量的增加而升高，呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系；鼠婦中劑量組的扭體反應(yīng)抑制率達(dá)74.002%，為最佳試驗(yàn)藥物濃度。見表1。

表1 鼠婦乙酸乙酯提取物對(duì)冰醋酸誘發(fā)小鼠扭體反應(yīng)的影響

注：①與生理鹽水組比較，P<0.05。

2.2各組嗎啡刺激小鼠豎尾情況 嗎啡組小鼠注射嗎啡注射液15 min后均出現(xiàn)S型豎尾現(xiàn)象,而鼠婦各劑量組小鼠均未出現(xiàn)S型豎尾現(xiàn)象。

2.3各組納洛酮催癮小鼠跳躍情況 嗎啡組小鼠注射納洛酮注射液催癮后，在高臺(tái)上均出現(xiàn)跳躍現(xiàn)象；鼠婦各劑量組小鼠注射納洛酮注射液催癮后均未出現(xiàn)跳躍現(xiàn)象。

2.4鼠婦乙酸乙酯提取物對(duì)COX酶的抑制情況 鼠婦乙酸乙酯提取物對(duì)COX-1酶和COX-2酶均有抑制作用，且隨藥物濃度的增加抑制作用逐漸增強(qiáng)，其對(duì)COX-1酶的抑制作用優(yōu)于對(duì)COX-2酶的作用。鼠婦乙酸乙酯提取物對(duì)COX-1酶的IC50為22.723 ng/mL，對(duì)COX-2酶的IC50為33.512 ng/mL。見圖1。

圖1 不同濃度鼠婦乙酸乙酯提取物對(duì)COX酶的抑制情況

3 討 論

鼠婦又名濕蟲、潮濕蟲、地虱等，是無脊椎動(dòng)物節(jié)肢動(dòng)物門甲殼綱潮蟲亞目潮蟲科鼠婦屬，味酸、性涼、無毒。鼠婦主要藥用有效成分有蛋白質(zhì)、黏多糖、軟骨素、蟻酸、還原糖、多種飽和及不飽和脂肪酸等，而各種溶劑提取的藥用成分也不盡相同[8-9]。目前鼠婦常用的提取方法有蒸餾法、酸堿法、酶提取法等，常用的有機(jī)溶劑有水、葡萄糖、乙醇、乙醚、石油醚、乙酸乙酯、丙酮、氯仿等，其中鼠婦水提取物的主要成分為甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、天門冬氨酸、γ-氨基丁酸、亮氨酸、異亮氨酸等多種蛋白多肽[10]；鼠婦乙酸乙酯提取物的主要成分是甾體類化合物，包括β-谷甾醇、7α-羥基膽固醇、7β-羥基膽固醇、麥角甾醇、5-烯-3β-膽固醇等[7]。本實(shí)驗(yàn)觀察了鼠婦乙酸乙酯提取物的鎮(zhèn)痛作用、安全性，結(jié)果顯示鼠婦各組的扭體次數(shù)均明顯少于生理鹽水組，鼠婦低、中、高劑量組扭體反應(yīng)抑制率分別為39.252%，74.002%，96.794%，說明鼠婦乙酸乙酯提取物具有確切的鎮(zhèn)痛效果，且呈劑量依賴性。2個(gè)成癮性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鼠婦各劑量組小鼠成癮反應(yīng)均未引出，提示鼠婦乙酸乙酯提取物的鎮(zhèn)痛作用不具有成癮依賴性，說明鼠婦乙酸乙酯提取物3個(gè)劑量范圍內(nèi)的實(shí)驗(yàn)用藥安全可靠。

前列腺素(PG)是重要的致痛物質(zhì)，而COX酶是催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為PG合成過程中的所需酶，也是PG合成初始過程中的關(guān)鍵限速酶。非甾體類抗炎藥就是通過抑制PG生成的COX酶途徑而發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用的[11-12]。COX酶是一種雙功能酶，具有環(huán)氧化酶和過氧化氫酶活性，可以催化多種環(huán)氧化物和芳烴氧化物的水解過程[13-14]。目前發(fā)現(xiàn)COX酶具有2種同工酶，即COX-1酶和COX-2酶。COX-1酶為結(jié)構(gòu)型，是要素酶，廣泛存在于胃、血管、腎等正常組織中，它催化生成的PG參與機(jī)體正常的生理過程，如可調(diào)節(jié)胃黏膜周圍的血流、胃黏液的分泌，從而起到保護(hù)胃黏膜的作用；可調(diào)節(jié)血小板的聚集、外周血管阻力及腎臟血流量分布，具有保護(hù)功能[15-16]。COX-2酶為誘導(dǎo)型，是誘導(dǎo)酶，即給予一定刺激后迅速產(chǎn)生的酶，可由多種化學(xué)、物理和生物因子損傷性刺激而誘導(dǎo)產(chǎn)生，激活的磷脂酶A2水解細(xì)胞膜磷脂，生成花生四烯酸，后者經(jīng)COX-2酶催化加氧生成PG，催化PG合成參與炎癥反應(yīng)的過程[17-19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鼠婦乙酸乙酯提取物對(duì)COX-1酶和COX-2酶均有抑制作用，且對(duì)COX-1酶的抑制作用優(yōu)于對(duì)COX-2酶的作用，并隨給藥濃度的增加抑制作用逐漸增強(qiáng)。表明鼠婦乙酸乙酯提取物是通過抑制COX-1酶、COX-2酶而起到鎮(zhèn)痛作用的。

綜上所述，鼠婦乙酸乙酯提取物對(duì)于疼痛模型小鼠具有明顯鎮(zhèn)痛作用，且該作用無成癮性，其是通過抑制COX酶途徑而發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用的。