周聯(lián)明，張學(xué)利，楊 治，檀占海，孫家亮，朱光輝

(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院南院/上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院，上海 201499)

結(jié)腸癌是常見的胃腸道腫瘤，發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，其發(fā)生發(fā)展是多基因和多步驟的過程。由于結(jié)腸癌位于腹腔中，內(nèi)鏡和影像學(xué)檢查為主，操作復(fù)雜，早期診斷較為困難。因此尋找早期發(fā)現(xiàn)和診斷，并明確其生物特性尤其重要。微小RNA(miRNA)是一類非編碼的小分子RNA，在基因轉(zhuǎn)錄水平對人體關(guān)鍵的生理過程具有一定的調(diào)控作用[1]。最新的研究表明miRNA具有類似癌基因和抑癌基因的作用，對結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移具有重要作用[2]。miR-34 c類似抑癌基因，其高表達(dá)對機(jī)體的有保護(hù)作用，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用[3]；另一個基因miR-127-3p類似癌基因，在腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用[4]。目前，聯(lián)合檢測miR-34 c和miR-127-3p基因在結(jié)腸癌中表達(dá)尚未見文獻(xiàn)報道，本研究通過聯(lián)合檢測結(jié)腸癌患者血清miR-34 c和miR-127-3p的表達(dá)水平，旨在觀察其與臨床病理因素的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 臨床資料

1.1一般資料 本研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過。選擇2012年1月—2015年12月在我院就診行手術(shù)治療的結(jié)腸癌患者183例，結(jié)腸腺瘤患者60例，分別納入結(jié)腸癌組和結(jié)腸良性腫瘤組?；颊呔?jīng)病理證實，術(shù)前無放療、化療和全身治療；所有患者對研究知情同意。排除其他惡性腫瘤患者，血液系統(tǒng)疾病和免疫系統(tǒng)疾病者，不愿意參加本研究的患者。結(jié)腸癌組男104例，女79例；年齡35～70(54.68±11.35)歲；腫瘤浸潤深度侵及漿膜層95例，未及漿膜層88例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期61例，Ⅲ～Ⅳ期122例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性54例，陰性129例。結(jié)腸良性腫瘤組男35例，女25例；年齡35～70(54.68±9.67)歲。選擇同期在我院行健康體檢者30例為健康對照組，男17例，女13例；年齡35～70(53.98±11.65)歲。各組年齡和性別等一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1血液標(biāo)本的抽取 患者入院時和手術(shù)15 d后空腹取肘靜脈血，將標(biāo)本分別裝于干燥試管中4 mL。干燥試管中的血液標(biāo)本予以室溫下靜置1 h，以3 000 r/min離心5 min，離心半徑9 cm，將血清保存在-70 ℃的冰箱中保存待檢測。

1.2.2Real time PCR檢測血清miR-34 c和miR-127-3p表達(dá) 按照試劑盒說明書抽提細(xì)胞總RNA。提取的總RNA各取5 μL至EP管中，加入RNase-Free ddH2O至50 μL，混勻，以RNase-Free ddH2O為對照，使用石英微量比色杯測定A260及A280值，在1.8～2.1。根據(jù)A260定量結(jié)果，12組RNA抽提產(chǎn)物分別取1 μg RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。將樣品徹底混合均勻，短暫離心，37 ℃孵育60 min。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物-20 ℃保存。根據(jù)目標(biāo)基因的mRNA序列，按照引物設(shè)計的原則，用設(shè)計軟件primer express 3.0設(shè)計并合成qPCR檢測引物及探針，miR-34 c上游引物：5’-CGCGGATCCTCTATTTGCCATCGTCTA-3’，下游引物：5’-CTGAAGCTTCAGGCAGCTCATTTGGAC-3’； miR-127-3p的上游引物：5’-ACACTCCAGCTGGGTCGGATCCGTCTGAGC-3’，下游引物：5’-TGGTGTCGTGGAGTCG -3’。目標(biāo)基因探針和內(nèi)參基因探針均為5’端采用FAM報告熒光標(biāo)記，3’端采用TAMRA淬滅熒光標(biāo)記。取2 μg中RNA加入內(nèi)參U6和目的小分子RNA miR-34 c和miR-127-3p逆轉(zhuǎn)錄引物，在70 ℃反應(yīng)10 min后，取出立即冰育2 min，隨后加入其他試劑。其反應(yīng)程序為：42 ℃反應(yīng)60 min，70 ℃反應(yīng)10 min。立即將cDNA產(chǎn)物取出，快速置冰上冷卻-80 ℃以備后用。以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，在實時定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，其反應(yīng)條件為：在95 ℃反應(yīng)3 min，起到起始模板變性；在95 ℃反應(yīng)15 s，PCR循環(huán)中模板變性，然后60 ℃中反應(yīng)45 s起到退火的作用，共循環(huán)35次。采用相對定量的方法對miRNA進(jìn)行相對量表達(dá)進(jìn)行計算，以2-△△CT法分析基因相對表達(dá)量。

1.2.3觀察指標(biāo) 觀察結(jié)腸癌組、結(jié)腸良性腫瘤組和健康對照組的miR-34 c和miR-127-3p表達(dá)量變化，并觀察結(jié)腸癌患者血清miR-34 c和miR-127-3p表達(dá)量與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系及手術(shù)后其水平的變化及其相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1各組血清miR-34 c和miR-127-3p表達(dá)量比較 結(jié)腸癌組血清miR-34 c表達(dá)量為0.69±0.15，結(jié)腸良性腫瘤組為1.65±0.59，健康對照組為2.67±0.98，3組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=530.904，P<0.05)，結(jié)腸癌組血清miR-34 c表達(dá)量明顯低于良性腫瘤組和健康對照組(P均<0.05)，而良性腫瘤組明顯低于健康對照組(P<0.05)。結(jié)腸癌組血清miR-127-3p表達(dá)量為3.16±1.06，結(jié)腸良性腫瘤組為2.06±0.67，健康對照組為1.19±0.64，3組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=120.676，P<0.05)，結(jié)腸癌組血清miR-127-3p表達(dá)量明顯高于良性腫瘤組和健康對照組(P均<0.05)，而良性腫瘤組明顯高于健康對照組(P<0.05)。

2.2結(jié)腸癌患者血清miR-34 c和miR-127-3p表達(dá)與臨床病理因素的相關(guān)性 結(jié)腸癌患者血清miR-34 c和miR-127-3p表達(dá)量與年齡、性別、浸潤深度、脈管浸潤和神經(jīng)浸潤無明顯相關(guān)性(P均>0.05)，與腫瘤直徑、TNM分期、淋巴轉(zhuǎn)移和CEA表達(dá)具有明顯的相關(guān)性(P均<0.05)。見表1。

表1 血清miR-34 c和miR-127-3p表達(dá)量與結(jié)腸癌臨床病理因素的關(guān)系

2.3結(jié)腸癌患者手術(shù)前后血清miR-34 c和miR-127-3p表達(dá)的變化 結(jié)腸癌根治術(shù)后，miR-34 c表達(dá)量為1.86±0.81，較術(shù)前明顯升高(t=19.213，P<0.05)；miR-127-3p表達(dá)量為1.16±0.62，較術(shù)前明顯降低(t=22.032，P<0.05)。

2.4結(jié)腸癌患者血清miR-34 c和miR-127-3p表達(dá)的相關(guān)性 結(jié)腸癌患者的血清miR-34 c表達(dá)量與miR-127-3p表達(dá)量呈明顯的負(fù)相關(guān)(r=-0.684，P<0.05)。

3 討 論

miRNA是一類非編碼單鏈RNA，是一類小型核糖核酸，長度為18～26個核苷酸[5]。其廣泛存在于動物和病毒中，能夠通過堿基配對的方式作用于靶mRNA，并在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因的翻譯和表達(dá)，對細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移，個體發(fā)育和代謝均具有重要作用，參與機(jī)體的生理和病理過程。近年來miRNA在結(jié)腸癌中的診斷和療效觀察中的作用得到了肯定，但由于標(biāo)本不易得到，操作過程復(fù)雜，一定程度限制了其在臨床的應(yīng)用[6-7]。而外周血中的miRNA長期穩(wěn)定，并有一定組織特異性，與腫瘤的病理學(xué)特征具有密切的聯(lián)系，在惡性腫瘤的診斷、治療和預(yù)后判斷方面具有很高的臨床價值[8-9]，被認(rèn)為是一種非常有前途的腫瘤標(biāo)記物[10]，為腫瘤的診斷、療效和預(yù)后的判斷提供了新的思路。

miR-34 c是miR-34家族的重要成員，在多種腫瘤的形成和發(fā)生發(fā)展具有重要作用，在肝癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、鼻咽癌和白血病患者中呈低表達(dá)，而轉(zhuǎn)染miR-34 c基因后，腫瘤的發(fā)生發(fā)展明顯受到抑制，說明miR-34 c具有抑癌基因的作用[11-13]。本研究表明結(jié)腸癌患者血清miR-34 c表達(dá)量明顯低于結(jié)腸良性腫瘤者和健康對照者，說明miR-34 c可能參與結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展過程。本研究還發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌患者的血清miR-34c表達(dá)量與腫瘤直徑、腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有明顯的相關(guān)性，結(jié)腸癌患者血清miR-34 c表達(dá)量越低，則患者腫瘤直徑越大、分期越晚和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能性越大，而腫瘤的分期和淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移是預(yù)后的重要指標(biāo)，說明miR-34 c在結(jié)腸癌的預(yù)后判斷方面具有重要價值。同時本研究還發(fā)現(xiàn)手術(shù)后結(jié)腸癌患者血清miR-34 c表達(dá)量明顯高于手術(shù)前，因此miR-34 c在在結(jié)腸癌形成、發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中扮演著重要角色，具有類似抑癌基因的作用。本研究還發(fā)現(xiàn)機(jī)體miR-34 c表達(dá)量與CEA水平存在相關(guān)性，為結(jié)腸癌預(yù)后的重要指標(biāo)，但其具體機(jī)制仍不清楚。

miR-127-3p在結(jié)腸癌和白血病表達(dá)增高，在骨肉瘤中表達(dá)降低[14]，而在結(jié)腸癌患者中的表達(dá)情況報道較少。本研究表明結(jié)腸癌患者血清miR-127-3p表達(dá)量明顯高于良性結(jié)腸腫瘤者和健康對照者，說明結(jié)腸癌患者血清miR-127-3p表達(dá)量可以用于結(jié)腸癌患者的輔助診斷，其作用與用于惡性膠質(zhì)瘤的診斷類似[15]。本研究表明結(jié)腸癌患者血清miR-127-3p表達(dá)與腫瘤直徑大小、腫瘤分期、淋巴轉(zhuǎn)移和CEA具有密切的聯(lián)系，說明結(jié)腸癌患者血清miR-127-3p表達(dá)與結(jié)腸癌的預(yù)后具有明確的聯(lián)系，miR-127-3p表達(dá)量越高，結(jié)腸癌患者的預(yù)后越差，同時結(jié)腸癌患者血清miR-127-3p表達(dá)有助于結(jié)腸癌的早期診斷，但其具體機(jī)制尚不清楚。有研究表明miR-127-3p通過抑制sept7的表達(dá)，從而達(dá)到抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的遷移和侵襲作用，在結(jié)腸癌患者中是否通過上述機(jī)制尚不清楚[16]。本研究還發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌血清miR-127-3p表達(dá)量越高，結(jié)腸癌患者血清CEA水平越高，兩者可能均為結(jié)腸癌預(yù)后的重要指標(biāo)。本研究通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌患者血清miR-34 c表達(dá)與miR-127-3p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，同樣說明兩者具有內(nèi)在聯(lián)系。故miR-34 c、miR-127-3p和P53基因之間是否存在直接或者間接的聯(lián)系需要實驗的進(jìn)一步證實。

總之，miR-34 c和miR-127-3p基因參與了結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展，miR-34 c為抑癌基因，而miR-127-3p為促癌基因，在結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用。