李彥芹，劉 揚，梁麗玲，許 陽

在我國乃至全球，肺癌都具有高發(fā)病率和高死亡率的特點，研究與肺癌相關(guān)的基因?qū)Ψ伟┑脑\斷及治療有重要意義。肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白1(lung cancer metastasisrelated protein 1，LCMR1)基因是從人肺巨細胞癌細胞系中分離的與肺癌轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)的基因[1]，GenBank 數(shù)據(jù)庫注冊號 (Gene ID：AY148462)。該基因全長949 bp，分子量約19 kD，編碼177個氨基酸，在人體多種組織中廣泛分布。前期研究發(fā)現(xiàn)，LCMR1基因的表達水平可以影響肺癌細胞的凋亡[2]，并且對癌癥的侵襲性起關(guān)鍵作用[3]。肺癌的發(fā)生發(fā)展在體內(nèi)存在復雜的信號網(wǎng)絡，本研究通過酵母雙雜交技術(shù)及免疫共沉淀、GST pull-down篩選及驗證LCMR1基因與其相互作用的蛋白，為肺癌的研究機制提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-LCMR1、pGEX-5T質(zhì)粒、pGEX-5T-LCMR1質(zhì)粒、pCMV-Myc質(zhì)粒及pcDNA3.0-flag質(zhì)粒由本實驗室前期構(gòu)建并保存。pGBKT7 Cloning Vector、陽性對照載體pCL1、酵母菌株AH109、Matchmarker試劑盒購自美國Clontech公司，感受態(tài)大腸桿菌DH5α購自北京天根生物公司。人胚腎293細胞、A549細胞、95D細胞、大腸桿菌BL21由我室保存。質(zhì)粒提取純化試劑盒購自美國QIAGEN公司，GST Bind Resin購自美國Novagen公司，TNT T7 Quick體外翻譯轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Promega公司。Flag標簽抗體購自Sigma公司，Myc標簽抗體購自Abcam公司，β-acting抗體購自SantaCruz公司。

1.2 誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入AH109 復蘇轉(zhuǎn)化有pGBKT7-LCMR1的凍存菌液于LB培養(yǎng)液中，37 ℃、200 r/min過夜振蕩培養(yǎng)，增菌后提取質(zhì)粒pGBKT7-LCMR1。按照Clontech說明書將pGBKT7-LCMR1轉(zhuǎn)化入AH109中，AH109/pGBKT7作為空載體對照，轉(zhuǎn)化后的各組菌液取100 μl 接種至SD/- Trp平板，30 ℃倒置培養(yǎng)，觀察克隆生長情況。未轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的AH109作為陰性對照，接種至YPDA培養(yǎng)液中，30 ℃ 250 r/min振蕩培養(yǎng)18～20 h。從SD/-Trp平板上挑取1個轉(zhuǎn)化了誘餌載體的AH109菌落，加入YPDA培養(yǎng)液中30 ℃ 250 r/min振蕩培養(yǎng)，提取酵母蛋白，Western blot 驗證BD-LCMR1 融合蛋白的表達。

1.3 95D細胞cDNA文庫的構(gòu)建與篩選 復蘇肺癌95D細胞，按照TRIZOL說明書提取95D細胞總RNA，1%甲醛變性凝膠電泳驗證RNA完整性，合成cDNA第一鏈后，應用長距離PCR擴增ds cDNA，將ds cDNA、pGADT7-Rec、pGBKT7 -LCMR1共轉(zhuǎn)化酵母菌AH109，涂布于150 mm SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp四缺板，以共轉(zhuǎn)pGBKT7-Lam及pGADT7-RecT為陰性對照，以共轉(zhuǎn)pGBKT7-53、pGADT7 - RecT為陽性對照，30 ℃培養(yǎng)3～8 d。

1.4 排除假陽性克隆 選擇SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培養(yǎng)板上的生長良好的白色克隆重復劃線2～3輪，再將克隆涂布于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal平板培養(yǎng)，觀察菌落生長及顯色情況，排除假陽性克隆。提取候選克隆酵母質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5α，涂布于LB/Amp+(60 μg/ml)平板，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜，挑取單個克隆，接種于5ml LB/Amp+，提取文庫質(zhì)粒。將單個文庫質(zhì)粒與pGBKT7- LCMR1誘餌質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入酵母菌AH109。將菌液涂于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp和SD/ -Ade / -His/-Leu/-Trp/X-α-Gal，回復驗證候選文庫質(zhì)粒與誘餌蛋白的相互作用。提取陽性克隆測序。

1.5 免疫共沉淀法細胞內(nèi)驗證蛋白相互作用 TRIzol法提取293細胞RNA，合成cDNA第一鏈，設計含特殊酶切位點的基因引物，引物序列如下。RPL29上游：ggaggatccatggccaagtccaagaacc；下游：ggcctcgagctactctgaagcctttgtag。GNG5上游：ggggatccaccatgtctggctcctcc；下游ggcctcgagaggagtggtttgggaaacc。LCMR1上游：atgtgtcgaccatgagggaactgccaggtag；下游：taatgcggccgcttagcgtaggctgctgctgc。按Promega內(nèi)切酶說明書對RPL29的PCR產(chǎn)物、GNG5的PCR產(chǎn)物及pcDNA3.0-flag質(zhì)粒進行BamH Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切，對LCMR1的PCR產(chǎn)物及pCMV-Myc質(zhì)粒進行Sal Ⅰ及Not Ⅰ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)DNA連接酶4 ℃過夜，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)DH5α。提取重組質(zhì)粒，對質(zhì)粒進行回復酶切驗證及測序驗證。將帶Myc標簽的pCMV- Myc- LCMR1質(zhì)粒及有Flag標簽的pcDNA3.0- flag- RPL29質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細胞，提取細胞蛋白，用Flag抗體進行免疫共沉淀反應，用Myc抗體進行Western blot分析，以單獨轉(zhuǎn)染pCMV- Myc- LCMR1質(zhì)粒及單獨轉(zhuǎn)染pcDNA3.0- flag- RPL29質(zhì)粒作為陰性對照。

1.6 GST pull down體外驗證蛋白相互作用 將pGEX-5T質(zhì)粒、pGEX-5T- LCMR1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH-5α，挑取菌落增菌，加入終濃度為0.6 mM 的IPTG，20 ℃誘導4 h，超聲破碎細菌蛋白，經(jīng)GST瓊脂糖珠純化，12.5%SDS-PAGE 電泳，考馬斯亮蘭染色，檢測GST蛋白及GST-LCMR1 融合蛋白誘導表達情況。利用TNT兔網(wǎng)織紅細胞裂解液體系，根據(jù)TNT T7 Quick體外翻譯轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書在體外分別轉(zhuǎn)錄翻譯RPL29蛋白及GNG5蛋白，用35S 標記蛋白全長。向預處理好的GST Bind Resin中加入GST 融合蛋白粗提液、體外翻譯蛋白、10% BSA及裂解Buffer，共同孵育后，離心收集混合物通過12.5% SDS-PAGE電泳。凝膠經(jīng)干膠儀60 ℃干膠60 min，置于暗盒，-80 ℃曝光。

2 結(jié) 果

2.1 誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化AH109 以pGBKT7-LCMR1質(zhì)粒DNA為模板，經(jīng)PCR反應并電泳，獲得600 bp單一特異產(chǎn)物(圖1)。誘餌質(zhì)粒無自激活作用，對宿主無毒性(結(jié)果略)。pGBKT7-LCMR1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入酵母菌AH109后，涂于SD/-Trp平板，30 ℃倒置培養(yǎng)4 d，出現(xiàn)2～3 mm白色菌落，質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化酵母菌。提取轉(zhuǎn)化有pGBKT7-LCMR1的酵母菌總蛋白，經(jīng)12%SDS-PAGE電泳，Western blot結(jié)果顯示，所檢測蛋白分子量約40 kD，條帶單一，表明BD-LCMR1融合蛋白表達正確。

圖1 LCMR1編碼區(qū)PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳

2.2 95D細胞cDNA文庫的構(gòu)建與篩選 肺癌95D細胞總RNA完整性經(jīng)1%甲醛變性凝膠電泳檢測，出現(xiàn)3條帶，分別是28S、18S和5S，且28S亮度是18S的2倍，提示總RNA質(zhì)量合格(圖2)。以95D總RNA為模板長距離PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳結(jié)果顯示出完整彌散狀條帶，大小在250～6000 bp，符合文庫構(gòu)建要求(圖3)。將共轉(zhuǎn)化菌液涂布于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp四缺平板，3～8 d后平板上有2～3 mm白色菌落長出，共獲得20個候選克隆。

2.3 排除假陽性克隆 將20個候選克隆在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培養(yǎng)板上劃線培養(yǎng)2～3次，有16個克隆生長良好。將16個克隆在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal平板培養(yǎng)，獲得12個藍色克隆。將上述12個文庫質(zhì)粒與誘餌質(zhì)粒再次共轉(zhuǎn)化酵母菌，經(jīng)四缺平板及X-α-Gal篩選，最終獲得6個陽性克隆。對6個陽性克隆質(zhì)粒進行測序分析并BLAST比對，確定6種文庫片段，分別是GNG5、核糖體蛋白L29(RPL29)、DEK、CCAR1、G3BP1及LGMN。

圖2 總RNA 1%甲醛變性電泳

圖3 瓊脂糖凝膠電泳

2.4 免疫共沉淀法細胞內(nèi)驗證蛋白相互作用 通過對LCMR1及目的文庫基因RPL29、GNG5設計含特殊酶切位點引物，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳驗證，擴增成功(圖4)。對PCR產(chǎn)物及工具載體雙酶切連接后，提取重組載體pcDNA3.0-flag -RPL29、pcDNA3.0 -flag-GNG5和pCMV-Myc-LCMR1，經(jīng)雙酶切回復驗證及測序比對，證實重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。免疫共沉淀實驗結(jié)果顯示，單獨轉(zhuǎn)染pCMV- Myc- LCMR1質(zhì)?；騿为氜D(zhuǎn)染pcDNA3.0- flag- RPL29質(zhì)粒蛋白上樣孔，利用Flag抗體進行免疫共沉淀反應，用Myc抗體進行Western blot分析，沒有檢測到蛋白Myc-LCMR1的存在(陰性對照)；在pCMV- Myc- LCMR1質(zhì)粒和pcDNA3.0- flag- RPL29質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞蛋白，經(jīng)Flag抗體免疫沉淀下來的蛋白混合物中，才可檢測到Myc-LCMR1的存在(圖5)。

圖4 瓊脂糖電泳

圖5 免疫共沉淀方法驗證LCMR1與RPL29

2.5 GST pull down體外驗證蛋白相互作用 GST及GST-LCMR1經(jīng)過IPTG誘導后，提取蛋白并純化，經(jīng)12.5%SDS-PAGE ，以GST蛋白為陰性對照，在分子量26 kD處出現(xiàn)單一特異條帶，而GST-LCMR1融合蛋白在47 kD處有單一特異性蛋白條帶，大小與GST-LCMR1融合蛋白理論分子量相符(圖6)，提示GST 蛋白及GST-LCMR1 融合蛋白純化成功。

圖6 GST瓊脂糖珠純化后的GST及GST-LCMR1融合蛋白

將純化的融合蛋白GST-LCMR1與RPL29共同孵育，混合物經(jīng)洗滌后經(jīng)SDS-PAGE電泳，所得凝膠進行放射自顯影實驗。結(jié)果顯示，在GST-LCMR1泳道出現(xiàn)與Input陽性對照組在同一位置出現(xiàn)單一特異條帶，證明LCMR1蛋白與RPL29蛋白可以在體外發(fā)生特異性結(jié)合，兩者有直接相互作用(圖7)。不同的是，GST-LCMR1組沒有檢測到與Input陽性對照組相同的條帶(圖8)，證實LCMR1與GNG5蛋白不能在體外發(fā)生相互作用。

圖7 GST pull down驗證LCMR1與RPL29體外相互作用

圖8 GST pull down驗證LCMR1與GNG5體外相互作用

3 討 論

蛋白質(zhì)必須通過與其他蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用才能實現(xiàn)其功能，這個過程貫穿于細胞的整個生理過程。酵母雙雜交系統(tǒng)正是這樣一種能高效篩選活細胞體內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)[4]，能為蛋白質(zhì)功能研究提供大量信息。經(jīng)研究證實95D細胞系為非小細胞肺癌中具有高侵襲性和轉(zhuǎn)移性的肺癌細胞系[5,6]，因此，本研究應用該技術(shù)以LCMR1為誘餌蛋白，對肺巨細胞癌95D細胞cDNA文庫進行篩選，最終獲得了6個陽性克隆，分別是GNG5、核糖體蛋白L29(RPL29)、DEK、CCAR1、G3BP1及LGMN，該6種蛋白對研究非小細胞肺癌具有很重要的科學價值。

DEK為原癌基因，其編碼蛋白由375個氨基酸殘基組成，在多種腫瘤組織中高表達。據(jù)文獻[7]報道，DEK蛋白與P53、NF-kB等蛋白發(fā)生相互作用，調(diào)節(jié)腫瘤細胞的凋亡、轉(zhuǎn)移、血管生成等重要功能。CCAR1主要參與細胞生長與凋亡，與β-catenin、P53等共同調(diào)節(jié)腫瘤細胞生長與凋亡，并在多種組織中高表達[8]。LGMN又名legumain，該蛋白在多種實體瘤中高表達[9]。G3BP1能負向調(diào)節(jié)病毒的轉(zhuǎn)錄水平[10]。由此可見，本研究篩選出的與LCMR1相互作用的蛋白都參與了腫瘤形成的重要環(huán)節(jié)，我們推測LCMR1與相互蛋白一起，在癌癥復雜的機制網(wǎng)絡中發(fā)揮了重要作用。

由于酵母雙雜交系統(tǒng)也存在假陰性的特點，RPL29蛋白和GNG5蛋白作為最感興趣蛋白，本實驗繼而通過免疫共沉淀實驗及GST-pull down技術(shù)重點驗證了與LCMR1相互作用的RPL29蛋白和GNG5蛋白。GNG5蛋白是一種三聚膜相關(guān)蛋白，能與膜表面相關(guān)受體結(jié)合，參與能量代謝。經(jīng)免疫共沉淀實驗及GST-pull down技術(shù)證實，LCMR1與其相互作用為假陰性。

RPL29基因定位于染色體3p21.3-p21.2[11]，該基因?qū)儆诤颂求w蛋白L29E家族，編碼大60S亞基核糖體蛋白的部分蛋白，由159個氨基酸組成。該蛋白除表達于細胞質(zhì)外，還以膜蛋白的形式表達于細胞表面。多項研究顯示，RPL29積極參與血管生成[12]，對腫瘤細胞血管營養(yǎng)再生有重要意義[13]。RPL29又名肝素結(jié)合蛋白 (heparin interacting protein，HIP)，早期研究即發(fā)現(xiàn)該蛋白能與肝素特異性結(jié)合，增強腫瘤細胞的粘附和親和能力[14]。腫瘤細胞核糖體蛋白異常表達的一個最顯著特點就是持續(xù)增殖，而核糖體主要是參與蛋白合成，腫瘤的進展需要更高效的核糖體翻譯機制，因此在結(jié)腸癌和甲狀腺癌組織中觀察到RPL29表達增加[15,16]，而抑制RPL29的表達后能激活caspase-3及磷脂酰絲氨酸外翻，導致腫瘤細胞凋亡增加，并增強了腫瘤細胞的化療敏感性[17]。HIP/RPL29可與細胞表面及細胞外基質(zhì)中眾多肝素/硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPGs)相作用[14]，調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生長、增殖和分化[18-21]。由此可見，HIP/RPL29在癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了很重要的作用。核糖體蛋白家族其他成員蛋白在肺癌中的作用已被闡明，在NSCLC患者組織中核糖體蛋白表達減少或磷酸化水平升高，提示預后不良[22-24]，但有關(guān)HIP/RPL29與LCMR1相互作用在NSCLC中的研究仍鮮有報道。

既往成果顯示，LCMR1蛋白表達與肺癌臨床分期相關(guān)[1]，該基因表達下調(diào)能抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移能力[2]。結(jié)合本研究酵母雙雜交技術(shù)及驗證結(jié)果，LCMR1與HIP/RPL29在體內(nèi)、體外存在真實相互作用，但目前兩者在肺癌中的具體機制還不清楚。我們推測，LCMR1有可能通過調(diào)節(jié)HIP/RPL29磷酸化水平或共同作用于下游相關(guān)分子，對NSCLC發(fā)揮重要作用，這一推測還有待驗證。因此，本研究在95D細胞中檢測到多種LCMR1相互作用蛋白，并驗證了LCMR1與RPL29蛋白有相互作用，與GNG5蛋白無相互作用，為進一步研究LCMR1蛋白在NSCLC中發(fā)揮的作用建立了科學的實驗方法。