王建業(yè) 孟霞 朱禮倩 朱國強(qiáng)

摘 要 重組DNA技術(shù)是面向本院碩士研究生的一門選修課，皆在使新入學(xué)的新生掌握分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的方法和原理，為接下來的論文研究夯實(shí)基礎(chǔ)。本文中，作者把多年來主講該門課程的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)和心得體會進(jìn)行總結(jié)。從課程內(nèi)容設(shè)置、實(shí)驗(yàn)原理的深度挖掘、綜合性實(shí)驗(yàn)的設(shè)置、問題導(dǎo)向的研究性教學(xué)等方面進(jìn)行展開。這既是對該門課程教學(xué)實(shí)踐的有益探索和總結(jié)，也為今后更好提升該門課程的教學(xué)質(zhì)量奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 重組DNA技術(shù) 教學(xué) 實(shí)踐

中圖分類號：G642 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.16400/j.cnki.kjdkx.2018.06.025

Abstract The reorganized DNA technology is an elective course for the master's graduate students in our institute， all of which are making new students master the methods and principles of molecular biology experiments and lay a solid foundation for the research of the next paper. In this article， the author summarizes the practical experience and experience of the course over the years. From the contents of the course， the depth of experimental principles， the establishment of comprehensive experiments， and the research oriented teaching of problem oriented teaching. This is not only a useful exploration and summary for the teaching practice of this course， but also a foundation for improving the teaching quality of this course in the future.

Keywords recombinant DNA technology； teaching； practice

重組DNA技術(shù)是我院開設(shè)的一門選修課，授課對象為一年級碩士研究生，課時(shí)為36個(gè)學(xué)士，包括理論課和實(shí)驗(yàn)課。該門課程在我院開課已有數(shù)十年，從最初的選課僅十余人發(fā)展至今天的近百人。在目前可見的參考書系列中，還沒有一本與重組DNA技術(shù)完全同名的教材，與之最為接近的參考書有國內(nèi)出版的《基因工程原理》或者國外的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。尤其是《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》一書，一直被譽(yù)為分子生物學(xué)技術(shù)的入門寶典，包括上下兩冊，內(nèi)容甚為豐富，涵蓋了分子生物學(xué)技術(shù)的各個(gè)方面，目前已是第三版。盡管如此，隨著生命科學(xué)學(xué)科整體的快速發(fā)展，各種新的分子生物技術(shù)不斷涌現(xiàn)，本門課程的講解內(nèi)容也需要做到與時(shí)俱進(jìn)不斷調(diào)整，以適應(yīng)科學(xué)研究的形勢發(fā)展。最終目的在于保證研一學(xué)生進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后，能夠盡快進(jìn)入角色，為順利開展論文研究工作打好必要的基礎(chǔ)。本人近年來一直承擔(dān)重組DNA技術(shù)課程的教學(xué)任務(wù)，對如何更好地開展該門課程的教學(xué)積累了一些心得體會，總結(jié)如下。

1 精選課程內(nèi)容，做到重點(diǎn)突出

隨著當(dāng)代生命科學(xué)的整體快速發(fā)展，各種分子生物學(xué)技術(shù)也快速涌現(xiàn)，這必然對重組DNA技術(shù)這門課的內(nèi)容設(shè)置提出更高要求，哪些內(nèi)容需保留或補(bǔ)充，需要考慮到當(dāng)前科學(xué)研究的實(shí)際狀況。我們認(rèn)為現(xiàn)代分子生物學(xué)或者基因工程真正的起步在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)之后，這之后的標(biāo)志性事件有很多，但包括限制性內(nèi)切酶在內(nèi)多種工具酶的發(fā)現(xiàn)，以及質(zhì)粒載體的開發(fā)才真正標(biāo)志著分子生物學(xué)黃金時(shí)代的到來，這一結(jié)論到今天仍不為過。今天，在生命科學(xué)所涉及的大部分研究中，工具酶和載體仍是必不可少的實(shí)驗(yàn)材料。因此，工具酶、質(zhì)粒載體以及PCR技術(shù)依然也必須應(yīng)該是本門課程中必不可少的章節(jié)，需要重點(diǎn)講解。核酸探針雜交技術(shù)在分子生物學(xué)研究中曾一度有著相當(dāng)高的應(yīng)用面，也是講解內(nèi)容之一。如早期在繪制基因組物理圖譜中，均需要用到Southern blot技術(shù)。但隨著測序技術(shù)的突飛猛進(jìn)和成本大幅降低，尤其是二代、三代測序技術(shù)的發(fā)展，基于核酸探針的雜交技術(shù)在研究中的應(yīng)用面少了很多。針對這種情況，鑒于探針標(biāo)記中需要用到特定的聚合酶，我們把探針標(biāo)記技術(shù)整合到工具酶章節(jié)中穿插做簡單講解，不再安排單獨(dú)章節(jié)來講。

PCR已是十分成熟的技術(shù)，很多研究生在本科階段已經(jīng)接觸過甚至能夠熟練使用，而熒光定量PCR，作為PCR技術(shù)衍生出來的一種試驗(yàn)手段，它的原理比一般PCR要復(fù)雜，牽涉到Ct值、溶解曲線等重要概念，尤其對引物設(shè)計(jì)要求較高，同時(shí)機(jī)器軟件的運(yùn)行參數(shù)設(shè)定也需要一些指導(dǎo)。熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性非常依賴于加樣的準(zhǔn)確性，同樣的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，兩個(gè)人加樣的習(xí)慣性動作差異產(chǎn)生的結(jié)果差異會很大。由于熒光定量PCR屬于價(jià)格較高的儀器，教學(xué)實(shí)驗(yàn)室通常不會購置。因此，我們在課堂僅講解熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)原理及其在科研中的應(yīng)用實(shí)例，由于課時(shí)限制，不作具體的實(shí)驗(yàn)教學(xué)安排，但要求學(xué)生借助網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)和參考其他文獻(xiàn)，對熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中所需要注意的實(shí)驗(yàn)步驟和細(xì)節(jié)加以總結(jié)以獲得好的結(jié)果。

2 實(shí)驗(yàn)方法背后的原理要講透

我院的碩士生來自不同高校，有些在本科階段已進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，有了一定的實(shí)驗(yàn)操作基礎(chǔ)。對大多學(xué)生，對某個(gè)具體的實(shí)驗(yàn)可能知道怎么操作，但方法背后的原理卻不曾深究，這反映在一些學(xué)生在進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室開展論文研究過程中，一旦遇到實(shí)驗(yàn)困難進(jìn)展不前時(shí)，缺乏獨(dú)立分析問題、找出癥結(jié)的能力。因此，我們認(rèn)為在授課中，不僅要講具體的實(shí)驗(yàn)步驟方法，對這種實(shí)驗(yàn)方法的原理更需要講深講透，即使課時(shí)有限，不能面面俱到，也應(yīng)該告知學(xué)生在哪些渠道能查到相關(guān)內(nèi)容。比如，質(zhì)粒提取是重組DNA技術(shù)的重點(diǎn)講解內(nèi)容，溶液1、2、3是其中的三個(gè)必備試劑。溶液1中的葡萄糖、溶液3中的醋酸鉀的功能，大多學(xué)生很不清楚。實(shí)際上加了葡萄糖僅僅只是為懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子底部，因此，如果溶液1中缺了葡萄糖其實(shí)對質(zhì)粒的抽提本身而言，幾乎沒有任何影響。回收后的水相含有足夠多的鹽，高濃度的鹽會水合大量水分子，因此DNA分子之間就容易形成氫鍵而發(fā)生沉淀。因此加入2倍體積乙醇并在室溫放置2分鐘后離心，質(zhì)粒DNA就能得到很好沉淀。我們在科研過程中就曾觀察到個(gè)別研究生在提取質(zhì)粒時(shí)，在酒精沉淀這一步會花費(fèi)至少5分鐘以上，想當(dāng)然的以為時(shí)間長一些會有好的效果，實(shí)際上放置于-20℃時(shí)間過長，反而會導(dǎo)致大量鹽的沉淀。講深講透這些實(shí)驗(yàn)步驟背后的原理，很自然地就能扭轉(zhuǎn)研究生中存在的一些錯(cuò)誤做法。

不同限制性內(nèi)切酶buffer存在相通性，很多學(xué)生并未意識到這個(gè)問題。酶切消化是常規(guī)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，目前在國內(nèi)市場流通的主流限制性內(nèi)切酶廠家有4～5個(gè)，不同公司酶的buffer體系代號不一樣，但不代表成分有多大差別，我們認(rèn)為作為研究生應(yīng)該對此有清楚認(rèn)識，做個(gè)有心人。美國NEB公司的buffer 2和buffer 3與日本Takara公司的buffer M和buffer H成分完全一樣，相互完全可以代替使用。即使是NEB公司的buffer 4，現(xiàn)在稱為Cutsmart buffer，與Takara公司的buffer T在成分上也高度相近。這些知識點(diǎn)的細(xì)化皆在讓學(xué)生認(rèn)識到，盡管叫法不同，但這些buffer在化學(xué)組成上基本就是4種類型，主要差異在于鹽離子的濃度，目前常用到的限制性內(nèi)切酶，通?？偰軐?yīng)4種buffer中的一種。通過比較，使得學(xué)生今后在處理一些少見的復(fù)雜實(shí)驗(yàn)時(shí)，知道怎么解決這些問題。比如在做雙酶切實(shí)驗(yàn)時(shí)，偶爾會碰到無法找到共用buffer的情況，如果對buffer體系組成有了很透徹的認(rèn)識，就能知道從低鹽buffer先酶切，再添加人工配置的鹽成分，調(diào)制成高鹽buffer，完成后續(xù)的酶切任務(wù)，而不必采用其它繁瑣的方法。

3 開展綜合性實(shí)驗(yàn)，打通知識鏈

為了與研究生的科研實(shí)際任務(wù)相對接，我們不單獨(dú)為某個(gè)具體的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目開設(shè)實(shí)驗(yàn)，而是設(shè)計(jì)一個(gè)綜合性實(shí)驗(yàn)，將各個(gè)主要知識點(diǎn)打通串聯(lián)在一起，完成時(shí)間為2周。這個(gè)實(shí)驗(yàn)如下設(shè)置：我們提供含有目的基因的質(zhì)粒及引物，要求學(xué)生對該目的片段進(jìn)行擴(kuò)增，然后與T載體連接。自行制作DH5感受態(tài)細(xì)胞，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，涂布平板。通過藍(lán)白斑篩選，挑取白斑接種LB 肉湯擴(kuò)增，小量提取質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。通過選定的限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，對陽性克隆送公司測序，要求學(xué)生能夠通過軟件讀懂測序圖譜，并對測序結(jié)果進(jìn)行同源性比較。

由于該綜合性實(shí)驗(yàn)需要很多相關(guān)儀器，而教學(xué)實(shí)驗(yàn)室又不可能配置全，我們會將學(xué)生根據(jù)所屬學(xué)科特征，充分利用各個(gè)導(dǎo)師實(shí)驗(yàn)室已有的儀器設(shè)備條件，將所有選課學(xué)生分成4～5人為一組，利用其所在的各個(gè)導(dǎo)師實(shí)驗(yàn)室來完成上述實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。對實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的問題，隨時(shí)通過電話等各種通訊工具保持溝通。要求各小組將實(shí)驗(yàn)結(jié)果以PPT形式在課堂上匯報(bào)，教師對每個(gè)小組的圖片以及PPT質(zhì)量進(jìn)行點(diǎn)評和結(jié)果分析，重點(diǎn)放在質(zhì)粒的提取質(zhì)量、瓊脂糖凝膠電泳圖片質(zhì)量以及酶切結(jié)果分析?？傊?，通過一個(gè)完整的實(shí)驗(yàn)周期，使得學(xué)生對PCR擴(kuò)增、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取和酶切鑒定都有了具體深入的掌握。

4 在不同章節(jié)中穿插演示生物軟件的使用

生物信息學(xué)在生命科學(xué)研究中占有重要地位，已成為一門獨(dú)立的課程，這其中包括一些分子生物學(xué)軟件的使用。在不同章節(jié)中穿插講解一些常用的分子生物學(xué)軟件，對于研究生順利開展課題研究十分必要。在限制性內(nèi)切酶章節(jié)中，我們給大家演示Primer 5.0和DNASTAR軟件在酶切位點(diǎn)分析中的應(yīng)用。在PCR技術(shù)章節(jié)中，我們以Primer 5.0軟件為代表，講解其在引物設(shè)計(jì)中的應(yīng)用，該軟件界面清晰、簡潔，在引物設(shè)計(jì)上使用頗廣。在講解測序技術(shù)章節(jié)中，我們告知學(xué)生不能完全依賴商家提供的序列，必須自己學(xué)會運(yùn)行Chromas程序來觀察峰形質(zhì)量來評價(jià)測序結(jié)果的可靠性，這包括如何去除不可靠序列，如何看待測序中的背景峰、套峰現(xiàn)象對測序結(jié)果的影響等。我們也會演示如何利用DNASTAR軟件包中Edit程序?qū)π蛄羞M(jìn)行編輯，利用SeqMan軟件對序列進(jìn)行打包，用Megalign軟件對不同序列進(jìn)行同源性比對等。我們還會講解MEGA、Clustal軟件在基因進(jìn)化樹和序列比對中的廣泛使用。

在掌握與該門課程相關(guān)的軟件基礎(chǔ)上，對其它一些軟件，包括一些繪圖軟件，鑒于課時(shí)有限，我們僅列出這些軟件的名稱，推薦學(xué)生通過各種途徑自主學(xué)習(xí)。

5 將實(shí)驗(yàn)操作中暴露的細(xì)節(jié)問題引入課堂

根據(jù)筆者的長期觀察，在不少學(xué)生的科研實(shí)踐中往往存在一些習(xí)慣性操作，看似不違反操作規(guī)程，但過于機(jī)械缺乏靈活性的變動，這些操作實(shí)際上會影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們把這些問題進(jìn)行總結(jié)，帶到課堂上與學(xué)生分析討論。比如，在提取質(zhì)粒的最后一步，參考書上要求是自然晾干或置于37℃溫箱，但時(shí)間都比較長，再用水或TE溶解質(zhì)粒。而現(xiàn)在隨著實(shí)驗(yàn)硬件的大為改善，離心濃縮儀在很多實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)愈發(fā)普遍，只需5～10分鐘，質(zhì)粒就能完全干燥。如果仍舊習(xí)慣性的加入TE緩沖液后直接吹打溶解，質(zhì)粒很容易斷裂，造成提取的質(zhì)粒質(zhì)量不高，超螺旋質(zhì)粒比例下降。我們主張的做法是，在加入緩沖液后，將Eppendorf管在37℃自然浸泡10分鐘，以讓經(jīng)過抽真空干燥的質(zhì)粒自然軟化，然后再用槍頭輕柔吹打混勻。這些細(xì)節(jié)在正規(guī)參考書上不會涉及，需要學(xué)生自己在實(shí)踐摸索中總結(jié)。我們把在科研實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)存在的這些問題，在課堂上就給學(xué)生指出，有利于學(xué)生在進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后的初期研究中就能夠得到好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

再比如，在酶切消化實(shí)驗(yàn)中，酶的加入量一般在0.5～1 l范圍。由于酶都保存于50%甘油體系中，粘稠度高于水，移液器吸取0.5 l，實(shí)際上都不到0.5 l，有些學(xué)生會刻意調(diào)整刻度多加一下，實(shí)際上完全沒有必要。這有兩方面原因，一是按照現(xiàn)有的20 l酶切體系和選擇性內(nèi)切酶的包裝，消化1 g質(zhì)粒，酶用量即使只有0.5 l，實(shí)際上也過量5～10倍；此外，由于甘油的粘稠度，沾在吸頭上也有不少的量，可以彌補(bǔ)吸取量的不足，這也是酶在最后一步加入的原因。把這些知識點(diǎn)在課堂中與學(xué)生進(jìn)行交流，讓學(xué)生盡早明白一個(gè)道理，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)很多時(shí)候確實(shí)要求加樣準(zhǔn)確、操作嚴(yán)謹(jǐn)規(guī)范；另一方面，很多試劑加入量允許一定的幅度波動，甚至是無法避免的，不必過分拘泥刻板要求。

總之，重組DNA技術(shù)是一門理論和實(shí)踐操作結(jié)合性很強(qiáng)的課程，涉及的內(nèi)容知識點(diǎn)很多。主講教師應(yīng)該有在一線多年從事分子生物學(xué)研究的扎實(shí)背景，還能不斷跟進(jìn)當(dāng)代生命科學(xué)研究中出現(xiàn)的新技術(shù)方法并整合到自己的課堂教學(xué)中。以立足于問題導(dǎo)向的教學(xué)模式在本門課堂教學(xué)中應(yīng)給予足夠重視，在教學(xué)內(nèi)容設(shè)置上不求面面俱到、但求重點(diǎn)突出。鼓勵(lì)學(xué)生充分利用互聯(lián)網(wǎng)平臺等各種渠道拓展課堂中未能涉及或者充分展開的內(nèi)容，以滿足實(shí)際科研的需要。在今后教學(xué)中，我們還要不斷提高課件的制作水平，做到圖文并茂，把重組DNA技術(shù)這門課程真正打造成面向本院碩士研究生的一門精品課程。

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