李茜腴 李綏著 華樹海

（1 廣東省湛江市第二中學(xué) 廣東湛江 524022 2 廣西省南寧市經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)第一初級(jí)中學(xué) 廣西南寧 530031）

目前高中階段開展的微生物培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)主要來自選修1 的內(nèi)容，但由于實(shí)驗(yàn)條件不足，開展該實(shí)驗(yàn)的學(xué)校并不多，即使有條件的學(xué)校開展該實(shí)驗(yàn)也是以小組的形式來操作，無法讓每個(gè)學(xué)生都有動(dòng)手操作的機(jī)會(huì)，不能讓學(xué)生掌握微生物接種的實(shí)驗(yàn)操作過程，導(dǎo)致學(xué)生的探究欲望無法滿足。實(shí)驗(yàn)室微生物培養(yǎng)使用的菌種是大腸桿菌，是一種生活在人和動(dòng)物腸道中的棲居菌，能夠?qū)λw造成污染，甚至引起人和動(dòng)物嚴(yán)重腹瀉或敗血癥。大腸桿菌的購買需要到國家指定的購買點(diǎn)才可以，廢棄菌種也需要經(jīng)過嚴(yán)格的高壓蒸汽滅菌后才能丟棄。 從菌種的購買及廢棄菌種的處理均可以看出大腸桿菌作為實(shí)驗(yàn)材料的繁瑣和危害之處。 培養(yǎng)學(xué)生的動(dòng)手操作能力和探究創(chuàng)新能力，教師可以指導(dǎo)學(xué)生利用安全的實(shí)驗(yàn)材料家庭輔助培養(yǎng)，滿足學(xué)生的探究欲望和動(dòng)手能力。 釀酒酵母菌對(duì)人和動(dòng)物無害且容易生長, 人們常利用它制作葡萄酒或面食發(fā)酵。 利用釀酒酵母菌作為微生物培養(yǎng)的菌種有著大腸桿菌所不具備的三大特點(diǎn)：即材料廣泛易得，安全無污染，自身分泌物可抑制雜菌生長。 本實(shí)驗(yàn)主要改變了微生物培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)材料和操作環(huán)境，將微生物的培養(yǎng)操作搬到家庭進(jìn)行，并改良了釀酒酵母菌培養(yǎng)基的配方，使用簡化的實(shí)驗(yàn)器材，采用簡單易操作的滅菌方法，對(duì)微生物培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化處理。 本實(shí)踐研究成果將給學(xué)生或教師提供一個(gè)既節(jié)省又簡單安全的微生物培養(yǎng)方法和思路。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 釀酒酵母菌： 酵母菌在現(xiàn)代分子和細(xì)胞生物學(xué)中常用作真核模式生物，其作用相當(dāng)于原核模式生物大腸桿菌［1］。釀酒酵母菌通常用于制作面食及釀酒，活性干酵母可在超市購買，它是用鮮酵母低溫干燥制成的,便于貯藏和運(yùn)輸?；钚愿山湍甘褂们耙蒙倭康臒o菌水將干酵母活化處理。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 試管10 支，1 mL 一次性注射器若干支，1 000 mL 規(guī)格的錐形瓶2 個(gè)，200 mL 燒杯2 個(gè)，100 mL 燒杯2 個(gè)，酒精燈2 個(gè)，電磁爐1個(gè)，2.5 mL 注射器2 個(gè)，培養(yǎng)皿8 個(gè)，涂布器1個(gè)，家用高壓鍋2 個(gè)，電子秤1 個(gè)。

1.3 黃豆粉培養(yǎng)基的用量和營養(yǎng)成分 經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)摸索出最合適的黃豆粉培養(yǎng)基成分用量，然后配置5 g 和10 g 的黃豆粉培養(yǎng)基進(jìn)行比較菌落特征和數(shù)目，用量和營養(yǎng)成分如表1 所示。

表1 1 000 mL 黃豆粉培養(yǎng)基配方

2 實(shí)驗(yàn)方法與步驟

2.1 釀酒酵母菌的活化 打開一包15 g 的活性干酵母粉倒入裝有100 mL 的無菌水的小燒杯中活化1 h，直至釀酒酵母溶解。

2.2 黃豆粉培養(yǎng)基的配置

1）計(jì)算：一般培養(yǎng)基配方是1 000 mL 含各種成分的含量。

2）稱量：分別用電子秤稱量5 g，10 g 黃豆粉（已磨制），以及5 g 葡萄糖和15 g 瓊脂粉各2 份。

3）溶化：將稱量好的原料分別倒入裝有150 mL 無菌水的錐形瓶中，電磁爐加熱，用玻璃棒攪拌使其溶解完畢（電磁爐不能直接加熱，需要放入電磁爐鍋中加熱）。然后加入稱量好的5 g 葡萄糖和15 g 瓊脂粉，加熱攪拌溶解，當(dāng)瓊脂完全溶化后，加水配制成1 000 mL 的培養(yǎng)基。

2.3 高壓鍋滅菌 將所有需要滅菌的玻璃儀器和配制好的培養(yǎng)基，用干凈報(bào)紙或用保鮮袋包好，小心放入高壓鍋內(nèi)的架子上，鍋底裝著少量水（注意不要過度用力以免壓壞玻璃儀器），裝有清水的試管加棉塞豎直放置，以免制備的無菌水傾倒出來。 利用家用高壓鍋對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器和培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌，當(dāng)高壓鍋內(nèi)充滿飽和蒸汽后，關(guān)閉放氣閥，適當(dāng)控制電源，繼續(xù)保持25 min，滅菌完成后關(guān)閉高壓鍋電源，等待玻璃儀器冷卻。由于家用高壓鍋太小，可以用2 個(gè)或多個(gè)高壓鍋進(jìn)行滅菌處理。家用高壓鍋的內(nèi)部溫度約為120℃，壓強(qiáng)超過100kPa［2］，達(dá)到高壓蒸汽滅菌鍋的標(biāo)準(zhǔn)。

2.4 倒平板 首先進(jìn)行實(shí)驗(yàn)環(huán)境消毒。用脫脂棉球蘸75%的酒精對(duì)實(shí)驗(yàn)臺(tái)桌面進(jìn)行消毒。 待酒精揮發(fā)后，點(diǎn)燃酒精燈，再用酒精擦拭實(shí)驗(yàn)者的雙手。實(shí)驗(yàn)操作盡量在干燥的環(huán)境下進(jìn)行，否則空氣中的水汽攜帶的大量細(xì)菌將會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

將滅菌后的培養(yǎng)皿放在酒精燈火焰旁的桌面上，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，左手拔出棉塞［3］。右手拿錐形瓶，使瓶口迅速通過火焰。將錐形瓶中的培養(yǎng)基（約30 mL）倒入培養(yǎng)皿，左手將培養(yǎng)皿蓋蓋上，將倒好的培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿放入已滅菌冷卻的高壓鍋內(nèi)，避免雜菌污染。因本次選用的黃豆粉培養(yǎng)基本身有些黏稠，故倒平板時(shí)要左右搖動(dòng)培養(yǎng)皿以便培養(yǎng)基流動(dòng)均勻覆蓋整個(gè)培養(yǎng)皿的底部。 待平板冷卻凝固后將培養(yǎng)皿倒扣在高壓鍋內(nèi)防止水珠滴落入培養(yǎng)基造成污染。

2.5 純化釀酒酵母菌 本實(shí)驗(yàn)采用的接種方法是稀釋涂布平板法。

1）釀酒酵母菌菌種的稀釋。 用一次性針筒向5 支試管里各注入4.5 mL 的無菌水，塞上棉塞，貼上標(biāo)簽，注明稀釋倍數(shù)（10-1稀釋至10-5）并放到試管架上待用。在酒精燈火焰旁搖勻菌液，用一次性注射器從調(diào)配好的釀酒酵母菌菌液中抽出0.5 mL，注入到裝有4.5 mL 無菌水并貼有“10-1”的試管中，搖勻，完成10-1的稀釋。 按梯度重復(fù)上述稀釋步驟，使菌液濃度稀釋至10-5。 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程需在酒精燈火焰旁完成，防止雜菌污染。

2）釀酒酵母菌接種。 向培養(yǎng)基中滴入一滴稀釋倍數(shù)為10-5的釀酒酵母菌菌液，用灼燒冷卻后的涂布器在平板上涂布均勻，后合上培養(yǎng)皿蓋，涂布器灼燒滅菌，再進(jìn)行下一個(gè)平板的涂布工作，將接種好的培養(yǎng)基倒扣在已滅菌冷卻的高壓鍋內(nèi)。

3）家用高壓鍋培養(yǎng)。 將接種好的6 個(gè)培養(yǎng)皿和2 個(gè)不接種的培養(yǎng)皿（做空白對(duì)照）疊好放置于已經(jīng)滅菌冷卻的2 個(gè)高壓鍋內(nèi)蓋上鍋蓋培養(yǎng)，接種的培養(yǎng)基在日平均溫度為28℃的環(huán)境下常溫培養(yǎng)72 h（培養(yǎng)期間的氣溫是24～29℃，滿足培養(yǎng)的條件）。 酵母菌生長的最適溫度是18～25℃，但經(jīng)過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)溫度在28℃時(shí)菌落形成更快，菌落更大。由于家庭沒有恒溫箱，學(xué)生可以用家用烤箱或微波爐控制培養(yǎng)溫度，或者結(jié)合當(dāng)?shù)氐臍鉁剡M(jìn)行常溫培養(yǎng)，注意白天和夜晚的溫差不要太大。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與討論

本實(shí)驗(yàn)采用了2 種不同含量的黃豆粉培養(yǎng)基進(jìn)行對(duì)比分析釀酒酵母菌生長所需要的營養(yǎng)條件。 通過對(duì)比菌落數(shù)目發(fā)現(xiàn)10 g 黃豆粉的培養(yǎng)基上長出來的菌落數(shù)目較5 g 黃豆粉培養(yǎng)基的密集些，而且菌落也大一些，說明10 g 黃豆粉的培養(yǎng)基營養(yǎng)更加充分。 通過實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的對(duì)比，2組空白對(duì)照組均無任何雜菌，2 組實(shí)驗(yàn)組的菌落數(shù)均在30～300 之間，說明采用家庭高壓鍋滅菌效果好，整個(gè)實(shí)驗(yàn)的無菌操作控制恰當(dāng)，實(shí)驗(yàn)效果明顯。 通過觀察釀酒酵母菌在黃豆粉培養(yǎng)基的生長情況，發(fā)現(xiàn)釀酒酵母菌的菌落呈乳白色，球形突起，表面光滑，奶油狀，不透明［4］，說明微生物家庭培養(yǎng)釀酒酵母菌實(shí)驗(yàn)成功。

4 本實(shí)驗(yàn)與教材對(duì)比情況

內(nèi)容見下頁表2。

5 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)主要改變微生物培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)材料、培養(yǎng)基配方、滅菌方法和培養(yǎng)條件，成功地在家庭里培養(yǎng)了釀酒酵母菌。 明顯的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象可以給學(xué)生提供在家里進(jìn)行微生物培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的參考，同時(shí)也培養(yǎng)了學(xué)生的核心素養(yǎng)。除了釀酒酵母菌外，還有乳酸菌和曲霉等菌種也可以作為家庭微生物培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)材料。但是為了防止菌種攜帶病原體，學(xué)生在選擇菌種時(shí)要通過正規(guī)途徑購買，例如超市銷售的釀酒酵母菌是用鮮酵母低溫干燥制成，安全無污染。還有防止菌種的變異和對(duì)環(huán)境的污染，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后需要對(duì)稀釋的菌種和接種過的培養(yǎng)基用高壓鍋滅菌后再丟棄。 對(duì)于不同菌種的使用要求的溫度不一樣，學(xué)生可以根據(jù)當(dāng)?shù)氐臍鉁剡x擇合適的菌種進(jìn)行培養(yǎng)，有利于培養(yǎng)條件的控制。在整個(gè)微生物培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的操作過程中，重要的是無菌操作，要求學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)操作工作臺(tái)做好滅菌消毒工作，選擇安全性能好，滅菌效果好的高壓鍋，實(shí)驗(yàn)過程做好無菌操作，這樣實(shí)驗(yàn)的成功率將會(huì)大大提高，減少對(duì)環(huán)境的污染。該實(shí)驗(yàn)的研究還可以讓學(xué)生在此基礎(chǔ)上探索開展“微生物的種群密度變化調(diào)查”“微生物豐富度調(diào)查”“飲用水及食品微生物污染的檢測”等實(shí)驗(yàn)。

表2 釀酒酵母家庭培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)對(duì)比