劉卉 劉宇宏

1西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液科（西安 710071）；2延安大學(xué)附屬醫(yī)院免疫血液科（陜西延安 716000）

利妥昔單抗是一種由小鼠抗體可變區(qū)序列和人源化抗體恒定區(qū)及Fc區(qū)序列組成的人鼠嵌合性抗CD20單克隆抗體［1］。利妥昔單抗通過與細胞表面上的CD20結(jié)合誘發(fā)的補體依賴性細胞毒作用和抗體依賴性細胞毒作用以及細胞凋亡作用來殺傷癌細胞［1-2］。利妥昔單抗已經(jīng)作為治療急性淋巴細胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）的重要手段之一。筆者通過臨床研究發(fā)現(xiàn)，ALL患者在臨床治療中對利妥昔單抗表現(xiàn)出一定的拮抗性，但是這種拮抗的分子機制尚未明確。大多數(shù)ALL患者白血病細胞僅表達淋巴細胞抗原，其中30%～40%前B細胞和80%～90%成熟B細胞表達CD20抗原［3］。CD20在ALL細胞的高表達為抗CD20單克隆抗體利妥昔靶向治療ALL提供了理論基礎(chǔ)［4］。但是關(guān)于CD20單核苷酸多態(tài)性與抗CD20的利妥昔單抗治療ALL之間的關(guān)系尚不明確，因此本研究報道了CD20編碼的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）rs2070770與急性淋巴細胞白血病對利妥昔單抗的響應(yīng)之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2012年1月至2017年2月確診為ALL的患者308例?；颊吣挲g0～30歲；男162例，女146例?；颊唠S機分為兩組，對照組（n=154）：患者接受5個療程常規(guī)化療；試驗組（n=154）患者在接受常規(guī)化療的同時聯(lián)合利妥昔單抗治療，每周劑量為375 mg/m2，連續(xù)使用4周。排除父母與子代均參與本研究。本研究通過醫(yī)院道德倫理委員會批準(zhǔn)?；颊吆炇鹬橥鈺?/p>

風(fēng)險組劃分：低危組包括超二倍體（51～65條染色體）、t（12；21）（p13；q22）和（或）ETV6?RUNX1；高危組包括亞二倍體（＜44條染色體）、t（v；11q23）、t（9；22）（q34；q11.2）和復(fù)雜染色體異常。在人口統(tǒng)計學(xué)和不同的疾病特征間基因型頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2 CD20 SNP基因分型CD20編碼的SNP rs2070770?Ala14Val基因分型通過 TaqMan SNP 基因分型技術(shù)檢測，并隨機選取每種基因型的PCR產(chǎn)物進行基因測序，驗證結(jié)果。基因型頻率符合Hardy?Weinberg平衡。

1.3 細胞表面CD20的表達水平使用流式細胞儀測量骨髓細胞平均熒光強度檢測CD20表達量。骨髓細胞與CD20?FITC在黑暗中孵育20 min，然后加入pH 7.2 NH4Cl裂解5 min，PBS清洗，1%多聚甲醛固定，流式細胞儀收集細胞，記錄數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法計量資料結(jié)果以s的形式表示，使用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布及方差齊性，兩組資料的比較采用配對t檢驗；兩樣本率之間的比較采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 rs2070770基因型頻率308例患者rs2070770基因分型：CC基因型157例（51.0%），CT基因型116例（37.7%），TT基因型35例（11.4%），等位基因T頻率為30.2%。對照組與試驗組間基因型頻率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），低危組與高危組間基因型頻率比較差異也無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 受試者CD20 rs2070770基因型頻率Tab.1 CD20 rs77878271 genotype frequencies of subjects

2.2 rs2070770基因型與白血病細胞表面CD20強度有關(guān)對照組、試驗組、低危組和高危組的純合子CC基因型患者的癌細胞CD20表達高于雜合子CT和純合子TT，雜合子CT患者的癌細胞CD20表達高于純合子TT患者。rs2070770等位基因T與細胞表面低CD20表達顯著相關(guān)（表2）。

表2 rs2070770基因型與淋巴細胞表面CD20表達Tab.2 rs2070770 genotype and cell surface CD20 expression in leukemic cells ± s

表2 rs2070770基因型與淋巴細胞表面CD20表達Tab.2 rs2070770 genotype and cell surface CD20 expression in leukemic cells ± s

組別對照組試驗組低危組高危組例數(shù)154 154 206 102 CC（n=157）CT（n=116）TT（n=35）n 76 81 137 20 CD20 262.1±12.3 178.7±9.1 121.6±9.0 228.2±15.7 n 59 57 101 15 CD20 126.7±10.2 158.7±10.8 88.3±6.3 183.1±8.6 n 18 17 30 5 CD20 34.5±4.6 55.8±4.9 38.9±3.8 50.5±4.5 χ2值7.82 7.29 8.56 6.43 P值＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

2.3 rs2070770基因型決定了急性淋巴細胞白血病臨床應(yīng)答rs2070770 SNP基因型與臨床終點OS（總生存期）、DFS（無病生存期）、RR（相對危險度）和TRM（病死率）有關(guān)。對照組rs2070770純合子CC基因型患者的RR為48.3%，試驗組rs2070770純合子CC基因型患者的RR為25.6%（P＜0.01）。兩組患者的DFS分別為45.5%和63.7%（P＜0.01）（表3）。相反的，利妥昔單抗治療后雜合子CT和純合子TT基因型患者RR與無利妥昔單抗治療組的RR無差異。不同基因型的患者5年OS和TRM差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，CT和TT基因型患者的療效相似。

表3 rs2070770 SNP基因型與患者的臨床終點Tab.3 Genetype of rs2070770 SNPand clinical outcome ± s

表3 rs2070770 SNP基因型與患者的臨床終點Tab.3 Genetype of rs2070770 SNPand clinical outcome ± s

臨床結(jié)局例數(shù)5年OS（%）DFS（%）RR（%）TRM（%）CC（n=157）CT（n=116）TT（n=35）對照組76 57.9±7.2 45.5±9.4 48.3±9.2 4.3±1試驗組81 64.2±7.1 63.7±7.3 25.6±7.2 8.2±5.5 P（χ2）值P（χ2）值P（χ2）值0.16（1.11）＜0.01（6.74）＜0.01（7.32）0.14（1.16）對照組59 67.2±7.6 62.2±9.5 38.2±9.3 3.3±3.5試驗組57 63.2±8.1 55.2±9.5 36.8±9.1 5.5±4.2 0.66（0.19）0.82（0.07）0.96（0.05）0.50（0.31）對照組19 68.9±10.2 54.7±10.6 45.6±10.8-試驗組16 66.9±12.4 51.5±12.5 43.6±10.8 1±2.2 0.82（0.07）0.98（0.05）0.86（0.06）0.29（0.82）

2.4 不同危險組rs2070770基因型患者利妥昔單抗治療的臨床療效在低危組，利妥昔單抗治療后CC基因型患者RR為10.5%，無利妥昔單抗治療組CC基因型患者RR為36.7%（P＜0.01）。相反的，利妥昔單抗治療后雜合子CT和純合子TT基因型患者RR與無利妥昔單抗治療組的RR無差異（表4）。在高危組，利妥昔單抗治療后CC基因型患者RR為35.6%，無利妥昔單抗治療組CC基因型患者RR為71.0%（P=0.07）（表5）。不同險組內(nèi)，不同基因型的患者5年OS和TRM沒有統(tǒng)計學(xué)差異。通過比較可知，利妥昔單抗對rs2070770 CC基因型患者響應(yīng)較好，而且在低危組的療效高于高危組。

表4 低危組rs2070770 SNP基因型與患者的臨床終點Tab.4 Genetype of rs2070770 SNPand clinical outcome in low risk group ± s

表4 低危組rs2070770 SNP基因型與患者的臨床終點Tab.4 Genetype of rs2070770 SNPand clinical outcome in low risk group ± s

臨床結(jié)局例數(shù)5年OS（%）DFS（%）RR（%）TRM（%）CC（n=137）CT（n=101）TT（n=30）對照組65 72.1±11.5 55.7±13.2 36.7±13.1 6.2±6.0試驗組72 90.3±7.5 84.4±9.2 10.5±8.2 6.2±6.5 P（χ2）值P（χ2）值P（χ2）值0.02（3.28）＜0.01（7.56）＜0.01（6.88）0.94（0.06）對照組57 87.8±8.2 72.2±13.5 25.6±13.1 2.0±4.0試驗組44 74.4±12.2 70.5±14.1 19.3±11.2 11.5±10.5 0.06（2.78）0.79（0.09）0.48（0.52）0.11（1.56）對照組15 85.3±17.2 61.5±18.2 39.5±18.3 0試驗組15 80.3±22.8 54.5±30.5 42.5±30.2 0 0.76（0.09）0.68（0.18）0.68（0.17）1.00（＜0.01）

表5 高危組rs2070770 SNP基因型與患者的臨床終點Tab.5 Genetype of rs2070770 SNPand clinical outcome in high risk group ± s

表5 高危組rs2070770 SNP基因型與患者的臨床終點Tab.5 Genetype of rs2070770 SNPand clinical outcome in high risk group ± s

臨床結(jié)局例數(shù)5年OS（%）DFS（%）RR（%）TRM（%）CC（n=20）CT（n=15）TT（n=5）對照組9 45.6±12.3 30.8±12.9 71.0±23.2 0±0試驗組11 41.3±19.5 43.5±20.6 35.6±27.1 21.5±23.5 P（χ2）值P（χ2）值 試驗組P（χ2）值0.77（0.09）0.50（0.31）0.07（2.12）0.13（1.18）對照組7 32.5±12.5 28.5±12.6 65.7±13.7 7.5±14.2試驗組8 60.2±12.1 56.8±12.5 44.5±12.6 0±0 0.06（2.15）0.11（1.21）0.26（0.85）0.27（0.98）對照組2 15.2±10.4-25.8±20.2 0±0 3--30.8±21.4 25.5±20.5 0.64（0.19）0.62（0.22）0.92（0.07）0.33（0.72）

3 討論

美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN）最新發(fā)布的臨床實踐指南指出可以考慮使用靶向作用于特定異常的新型免疫制劑，針對CD20表達B細胞譜系A(chǔ)LL的抗CD20單克隆抗體利妥昔單抗。最近有研究顯示，利妥昔單抗單藥治療CD20+急性淋巴細胞白血病具有一定的療效，在標(biāo)準(zhǔn)化療中加入利妥昔單抗效果更加顯著，可有效提高低中度風(fēng)險患者的生存率［5-6］。對于青少年急性淋巴細胞白血病，本研究結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)化療聯(lián)合利妥昔單抗可以有效改善患者的臨床結(jié)局，患者癌細胞CD20出現(xiàn)變異會降低利妥昔單抗對急性淋巴細胞白血病的治療療效。ALL的處理方案很大程度上與患者的年齡有關(guān)，15～39歲的患者可考慮采用治療兒童的強化療法，年齡≥40歲的成年人很難耐受大劑量的兒童強化療法，因此本研究的患者納入年齡范圍為0～30歲。

有研究報道CD20 rs2070770基因多態(tài)性的編碼、調(diào)控及細胞表面CD20表達與臨床結(jié)局有關(guān)［7-9］。本研究結(jié)果與前人研究保持一致，SNP rs2070770可以預(yù)測利妥昔單抗對急性淋巴細胞白血病的應(yīng)答，而且rs2070770基因型與白血病細胞表面CD20表達顯著相關(guān)。有研究報道利妥昔單抗的療效受限于CD20的高表達［10-11］和細胞較好的遺傳性［12-13］。因此本研究評價了不同危險組CD20基因型對利妥昔單抗療效的影響。利妥昔單抗聯(lián)合化療與單獨化療組相比，低危組和高危組CC基因型患者的RR幾乎下降了50%左右，DFS也出現(xiàn)一定程度的升高；當(dāng)患者出現(xiàn)T等位基因的時候，兩組患者的RR和DFS幾乎沒有變化。低危組與高危組對比后發(fā)現(xiàn)，利妥昔單抗對rs2070770 CC基因型患者響應(yīng)較好，而且在低危組的療效高于高危組。

綜上所述，rs2070770位點CC基因型患者在接受利妥昔單抗治療時效果較好，它是預(yù)測患者是否適于利妥昔單抗治療的一種潛在生物標(biāo)志物。而且對于不同危險程度的患者來說，低危險患者對利妥昔單抗的響應(yīng)更好。