王傳卓 辛鶴 劉波 劉兆玉

中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院介入科（沈陽 110004）

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年約1 360 000新發(fā)患者［1］，發(fā)病率和病死率成逐年上升趨勢(shì)。結(jié)直腸癌治療以手術(shù)切除及化療為主，臨床治療策略逐步改善，但5年生存率仍不理想，因此，尋找新的診療靶點(diǎn)及策略顯得尤為重要［2］。

microRNA是一類內(nèi)源性、短鏈、非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，參與眾多生理及病理過程［3］。大量研究［4］表明，幾乎在所有腫瘤都存在miRNA表達(dá)異常，miRNA在腫瘤發(fā)生及發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用。miRNA在結(jié)腸癌中的角色越來越受到關(guān)注，miR?34a也是其中一員，之前的研究已經(jīng)證實(shí)miR?34a可抑制結(jié)腸癌的生長和轉(zhuǎn)移［5-6］，但同時(shí)在細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證目前國內(nèi)外少有研究。本研究通過慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，在人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞系中過表達(dá)miR?34a，研究miR?34a對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響；并通過構(gòu)建裸小鼠皮下移植瘤模型，繪制腫瘤生長曲線，研究miR?34a對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞皮下移植瘤生長的影響，通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)聯(lián)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法揭示miR?34a對(duì)結(jié)腸癌生長的影響，為結(jié)腸癌的診療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及倫理本實(shí)驗(yàn)研究已通過中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核。4～6周齡Balb/c?nu裸小鼠20只，雌雄各半，體質(zhì)量16～20 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，于SPF環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及實(shí)驗(yàn)分組人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞（中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫）用含10%胎牛血清（Gibco公司）的RPMI1640培養(yǎng)液（Gibco公司）、于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。過表達(dá)miR?34a慢病毒和對(duì)照組空載慢病毒由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司包裝合成，目的基因慢病毒載體 GV309，引物序列：5′?GGAAAGGAC?GAAACACCGGATCCTTTCTTTCCTCCCCAC?3′［has?mir?34a（4174?1）?P1］，5′?TGTCTCGAGGTCGAGA?ATTAAAAAACGCAGAAGAGCTTCC?3′［has?mir?34a（4174?1）?P2］；對(duì)照組插入序列5′?TTCTCCGAAC?GTGTCACGT?3′。實(shí)驗(yàn)分兩組：miR?34a組（轉(zhuǎn)染過表達(dá)miR?34a的慢病毒載體）和NC組（陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染空病毒載體）。將SW480細(xì)胞以1×105/孔的細(xì)胞數(shù)接種于6孔板，細(xì)胞融合度達(dá)20～30%時(shí)，以MOI值=20感染SW480細(xì)胞，感染72 h后，細(xì)胞GFP綠色熒光率達(dá)85%以上，收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 Quantitativereal?timePCR（qRT?PCR）檢測(cè)按照TRIzol Regent試劑（Ambion公司）說明書方法提取細(xì)胞及移植瘤組織中的總RNA。使用Takara 公司 的 Mir?X miRNA First?Strand Synthesis Kit進(jìn)行miRNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，SYBR Advantage qPCR Premix進(jìn)行qRT?PCR檢測(cè)，以U6為內(nèi)參。LightCycler480進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下：模板預(yù)變性95℃、20 s；PCR反應(yīng)95℃、5 s，60 ℃、20 s，共40個(gè)循環(huán)，以2?ΔΔCt法計(jì)算 miRNA的相對(duì)表達(dá)量。引物由上海生工生物工程公司合成，miR?34a上游引物：5′?GGCAGTGTCTTAGCT GGTTG?3′，下游引物試劑盒內(nèi)提供；U6上游引物：5′?GGAACGATACAGAGAAGATTAGC?3′，下游引物：5′?TGGAACGCTTCACGAATTTGCG?3′。

1.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)按照北京碧云天公司的CCK?8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒說明書步驟操作。收集細(xì)胞、調(diào)整細(xì)胞懸液濃度5×104/mL，于96孔板中接種細(xì)胞懸液100μL/孔，37℃連續(xù)培養(yǎng)4 d，每天更換培養(yǎng)液。每孔加入10μL CCK?8試劑，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h后，酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處各孔的吸光值，繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)按照eBioscience公司的An?nexin V?APC單染法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書步驟操作。消化、離心、洗滌細(xì)胞。200μL 1×binding buffer重懸細(xì)胞沉淀，加入10μL Annexin V?APC染色，室溫避光15 min，再加入400 μL 1×binding buf?fer，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6 細(xì)胞周期檢測(cè)按照凱基生物公司的細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒說明書步驟操作。收集細(xì)胞、調(diào)整濃度為1×106/mL，取1 mL單細(xì)胞懸液、離心、去上清，加入500μL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇固定過夜。PBS洗去固定液，加入100μL的RNase A，37℃水浴30 min，再加入400μL的PI染色混勻，4℃避光30 min，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，記錄激發(fā)波長488 nm處紅色熒光。

1.7 裸鼠皮下移植瘤模型構(gòu)建及瘤體測(cè)量收集細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×107/mL，1 h內(nèi)使用。于裸鼠右后肢腹側(cè)皮下注射0.2 mL腫瘤細(xì)胞懸液，依據(jù)注射細(xì)胞不同，分為兩組：鼠?miR?34a組和鼠?NC組，每組10只，雌雄各半。術(shù)后繼續(xù)在SPF條件下飼養(yǎng)，正常飲食，觀察裸鼠皮下成瘤情況，每7天使用游標(biāo)卡尺測(cè)量裸鼠皮下移植瘤長徑（L）及短徑（W），利用公式V=（L×W2）/2計(jì)算體積，繪制移植瘤生長曲線。第28天頸椎脫位法處死裸鼠，完整取出皮下移植瘤，電子天平稱重。組織標(biāo)本于離體30 min內(nèi)保存，一半置于液氮中凍存，一半置于4%多聚甲醛溶液中固定。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 16.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR?34a在各組SW480細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)通過慢病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染方法，獲得了穩(wěn)定高表達(dá)miR?34a的SW480細(xì)胞株（圖1）。qRT?PCR檢測(cè)兩組細(xì)胞中miR?34a相對(duì)表達(dá)量的結(jié)果顯示：miR?34a組高于NC組（圖2a，t=-54.190，P＜0.05）。

圖1 慢病毒轉(zhuǎn)染后的SW480細(xì)胞及綠色熒光表達(dá)（左側(cè)為白光視野，右側(cè)為對(duì)應(yīng)熒光視野，×200）Fig.1 SW480 cells transfected with lentivirus were observed with white bright（left）and green fluorescence assay（right）in the same vision using fluorescence microscopy（× 200）

圖2a qRT?PCR檢測(cè)兩組細(xì)胞中miR?34a的相對(duì)表達(dá)量Fig.2a The relative expression of miR?34a was detected by qRT?PCRin cells

圖2b qRT?PCR檢測(cè)兩組皮下移植瘤中miR?34a的相對(duì)表達(dá)量Fig.2b The relative expression of miR?34a was detected by qRT?PCRin xenograft tumors

2.2 miR?34a對(duì)SW480細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響CCK?8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況的結(jié)果顯示（圖3）：隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，miR?34a組細(xì)胞增殖能力逐漸低于NC組，培養(yǎng)至第2天時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=18.832，P＜0.05）。流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況的結(jié)果顯示（圖4）：miR?34a組的凋亡率（10.44±0.29）%明顯高于NC組（3.93±0.06）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-65.026，P＜0.05）。流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞周期的結(jié)果顯示（圖5）：miR?34a組細(xì)胞G0/G1期為（48.81±0.64）%，低于NC組（52.48±0.64）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.125，P＜0.05）；miR?34a組細(xì)胞S期為（16.51±0.36）%，低于NC組（21.39±0.38）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=28.035，P＜0.05）；miR?34a組細(xì)胞G2/M期分別為（34.68±0.67）%，高于NC組（26.02±0.42）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-32.989，P＜0.05）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：miR?34a可抑制人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡，誘導(dǎo)細(xì)胞周期出現(xiàn)G2/M期阻滯。

圖3 CCK?8檢測(cè)miR?34a對(duì)結(jié)腸癌SW480增殖能力的影響Fig.3 CCK?8 method to detect the effect of miR?34a on SW480 cells proliferation

圖4 單染法、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果：右上象限與右下象限之和代表凋亡細(xì)胞所占百分比，miR?34a組的凋亡率高于NC組Fig.4 Single staining and flow cytometry were used to detect apoptosis：the sum of right upper and right lower quadrant represents the percentage of apoptotic cells and the apoptotic rate of miR?34a group was higher than that of NCgroup

2.3 miR?34a對(duì)裸鼠皮下移植瘤生長的影響皮下移植瘤生長曲線結(jié)果顯示（圖6），鼠?miR?34a組腫瘤生長速度慢于鼠?NC組，在接種細(xì)胞14 d后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.029，P＜0.05）。鼠?miR?34a組移植瘤最終體積和重量分別為（207.59±34.49）mm3和（199.64±35.28）mg，均低于鼠?NC組（272.53±31.72）mm3和（260.72 ± 43.09）mg（t=4.383，P＜0.05和t=3.469，P＜0.05）。qRT?PCR檢測(cè)兩組移植瘤中miR?34a相對(duì)表達(dá)量的結(jié)果顯示：鼠?miR?34a組高于鼠?NC組（圖2b，t=-55.474，P＜0.05）。上述結(jié)果表明：miR?34a可抑制裸鼠皮下移植瘤生長。

圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果：miR?34a組的第二峰（G2/M期）高于NC組Fig.5 Flow cytometry results in cell cycle：the second peak in the miR?34a group（G2/M phase）was higher than the NC group

圖6 裸鼠皮下移植瘤生長曲線Fig.6 Growth cruve of subcutaneously xenograft tumors

3 討論

miRNA是一類普遍存在于真核生物中、高度保守的非編碼RNA分子，由18～25個(gè)核苷酸組成，可通過與下游靶基因mRNA的3′UTR區(qū)序列互補(bǔ)結(jié)合，引起靶基因降解或抑制翻譯［7-8］。人miR?34a定位于染色體1q36.22，是一段比較脆弱的區(qū)域，在宮頸癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)miR?34a表達(dá)下降，其表達(dá)水平與惡性腫瘤的臨床分期、腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)［9-11］。研究表明［12］，miR?34a與經(jīng)典抑癌基因p53關(guān)系密切，p53可使miR?34a的CpG島啟動(dòng)子區(qū)域去甲基化，誘導(dǎo)miR?34a表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控miR?34a下游靶基因。但p53對(duì)miR?34a功能并非必須，在缺乏內(nèi)源性p53的情況下，miR?34a仍能抑制腫瘤細(xì)胞的生長。

腫瘤細(xì)胞的增殖能力是影響腫瘤進(jìn)展的重要因素，且與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期密切相關(guān)。研究［13-14］報(bào)道，miR?34a可靶向調(diào)節(jié) PDGFRA、PAR2等基因，進(jìn)而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。本研究通過CCK?8法測(cè)定miR?34a組細(xì)胞增殖能力低于NC組，培養(yǎng)至第72、96 h時(shí)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），證實(shí)了miR?34a可抑制人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖。凋亡是細(xì)胞程序性死亡過程，異常凋亡可導(dǎo)致多種疾病發(fā)生。細(xì)胞的凋亡受細(xì)胞凋亡基因嚴(yán)格調(diào)控，miR?34a對(duì)凋亡影響主要通過p53相關(guān)通路實(shí)現(xiàn)，參與p53下游的調(diào)控通路，抑制抗凋亡基因Bcl?2的表達(dá)，凋亡細(xì)胞比例增多，可有效抑制細(xì)胞增殖速率［15］，Bcl?2信號(hào)通路在細(xì)胞增殖與凋亡過程中發(fā)揮重要作用。本研究中miR?34a組的凋亡率明顯高于對(duì)照組，表明miR?34a可誘導(dǎo)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡，從而抑制其增殖速率，在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮“抑癌基因”作用。惡性腫瘤最基本的生物學(xué)特征之一是細(xì)胞周期調(diào)控紊亂導(dǎo)致的細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤細(xì)胞失控性增殖，細(xì)胞周期依賴激酶（CDKs）和細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）在G1期向S期過渡及G2期向M期過渡過程中發(fā)揮重要作用［15］。本研究通過外源性過表達(dá)miR?34a，使人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞G2/M期明顯高于對(duì)照組，說明過表達(dá)miR?34a可以誘導(dǎo)細(xì)胞周期出現(xiàn)G2/M期停滯，達(dá)到抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)衰老作用。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了，在體外條件下過表達(dá)miR?34a可抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖，增殖能力的降低可能通過誘導(dǎo)凋亡和細(xì)胞周期阻滯得以實(shí)現(xiàn)。miRNA可以通過多條信號(hào)通路影響下游靶基因，進(jìn)而改變細(xì)胞的生物學(xué)功能。本研究不足之處是缺少miR?34a的作用機(jī)制研究，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)是研究miRNA目的基因的經(jīng)典方法，進(jìn)一步檢測(cè)miR?34a下游的目的基因、闡明其作用機(jī)制是我們下一步的研究方向。

臨床實(shí)踐證實(shí)，腫瘤體積是制約腫瘤根治手術(shù)的關(guān)鍵因素之一，高腫瘤負(fù)荷使腫瘤更易發(fā)生轉(zhuǎn)移，故縮小腫瘤體積對(duì)根治腫瘤、延緩腫瘤進(jìn)展具有重要意義。生物體內(nèi)環(huán)境與外環(huán)境存在差異，體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可能與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)存在差異，我們通過種植裸鼠皮下瘤、繪制瘤體生長曲線及稱量瘤體最終重量的方法，進(jìn)一步證實(shí)miR?34a在體內(nèi)環(huán)境對(duì)結(jié)腸癌增殖的影響。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR?34a可抑制腫瘤的生長速度及腫瘤的最終重量，提示miR?34a在裸鼠體內(nèi)仍可發(fā)揮“抑癌基因”作用，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長，可能成為結(jié)腸直腸癌治療新的分子靶點(diǎn)。

綜上所述，miR?34a可抑制人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)凋亡、阻滯細(xì)胞周期，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)miR?34a可抑制裸鼠皮下移植瘤生長，miR?34a可能為結(jié)直腸癌的診療提供新的依據(jù)和分子靶點(diǎn)。