張基亮，韓雪，馬鶯，張?zhí)m威，2，*

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，黑龍江哈爾濱150001；2.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266100）

乳鐵蛋白是一個分子量約為80 kU的糖蛋白，參與多種生物學(xué)途徑，如抗炎、抗微生物、抗腫瘤以及促進成骨細胞增殖等[1]。由于其良好的生物學(xué)活性，人們對乳鐵蛋白的需求量日益增大。乳鐵蛋白可以從脫脂乳中提取，但更多獲得其的途徑是干酪生產(chǎn)中的副產(chǎn)物乳清。從乳清中提取乳鐵蛋白，不僅可以降低乳清高生物需氧量污染的環(huán)境問題，同時可以提高乳清利用率，獲得更多的乳鐵蛋白，是解決限制乳鐵蛋白應(yīng)用瓶頸的一個有效辦法。

從上世紀開始，許多分離純化乳鐵蛋白的方法被開發(fā)出來，不同提取乳鐵蛋白方法的利弊見表1[2-9]。

表1 提取乳鐵蛋白方法的利弊比較Table 1 Advantages and disadvantages of different methods on recovery lactoferrin

由于乳鐵蛋白對熱敏感，容易失活，因此，不需加熱、快速提取乳鐵蛋白勢在必行。納米材料研究是一個快速發(fā)展的科學(xué)領(lǐng)域，由于納米粒子在生物、環(huán)境和技術(shù)等領(lǐng)域都具有很廣泛的應(yīng)用潛力，發(fā)展趨勢很大程度上和納米粒子能夠提供的特殊性質(zhì)和如何改造以適應(yīng)需要的應(yīng)用有關(guān)。磁性納米粒子能夠有效地純化蛋白，對于其的研究以及在生命科學(xué)中的應(yīng)用很重要，從選擇性和可靠性來說磁性分離和純化特殊的蛋白是一個便利的方法[10]。磁性納米粒子另外的一個應(yīng)用價值體現(xiàn)在磁性納米粒子表現(xiàn)出來的超順磁性，這意味著在磁場存在的情況下，磁性納米粒子具有很強的磁性，而這種強磁性在撤去磁場時會立刻消失，磁性納米粒子就會重新懸浮于溶液中[11]。由于Fe3O4磁性納米粒子的各種優(yōu)點，其有可能成為滿足快速、高效乳鐵蛋白的材料。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

FeCl2·4H2O、FeCl3·6H2O：天津博迪化工股份有限公司；50%的腈氨、25%氨水、無水乙醇：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；伴刀豆蛋白A：北京coolaber公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉、四甲基乙二胺和過硫酸銨：阿拉丁試劑（上海）有限公司。

PW1800/10X射線衍射儀：荷蘭飛利浦公司；AVATAR-360傅里葉變換紅外光譜：美國賽默飛公司；S600掃描電鏡：日本日立公司；Lakeshore-7300振動磁強計：美國Lakeshore公司；Zetasizer Nano ZS90激光粒度儀：英國馬爾文公司。

1.2 方法

1.2.1 磁性納米粒子的制備

磁性納米粒子的制備采用共沉淀的方法，具體方法根據(jù)Alzahrani[12]的報道。將Fe3+和Fe2+以摩爾濃度比為2∶1的比例溶于250 mL去離子水中，完全溶解后轉(zhuǎn)移至三頸瓶中，將瓶口用膠塞封緊，并在溶液底部通入純度為99%的高純N210 min，去除溶液中的溶解氧。10 min后將除去氧的鐵離子溶液在100 r/min或200 r/min的機械攪拌下滴加濃度為25%的氨水10 mL，維持溶液的pH值在10～10.5的范圍內(nèi)，持續(xù)攪拌10 min。攪拌結(jié)束后，將三頸瓶置于80℃的水浴中維持30 min，并保持溶液的pH值在10以上。水浴結(jié)束后將鐵溶液轉(zhuǎn)移至燒杯中，用磁鐵在燒杯底部吸附反應(yīng)后所生成的黑色沉淀，待絕大部分吸附后，小心除去上清的液體，將沉淀分別用去離子水和乙醇清洗3次，去除未反應(yīng)的鐵及氨水，每步清洗結(jié)束后都用磁鐵吸附。最后將沉淀在80℃真空干燥箱內(nèi)烘干，研缽磨碎后備用。

1.2.2 磁性納米粒子的修飾

磁性納米粒子的修飾根據(jù)lai等[13]的方法略加修改，每20 mg磁性納米粒子與20 mL pH6.0的磷酸鹽緩沖液混合后，在額定功率為650 W的超聲功率下超聲30 min形成膠體溶液。5 mL濃度為2.5 mg/mL的腈氨溶液加入到膠體溶液中，繼續(xù)超聲30 min，然后將0.5 mL濃度為1 mg/mL的伴刀豆蛋白A（concanavalin A，Con A）溶液加入到膠體溶液中，繼續(xù)超聲30 min，整個超聲過程在4℃的環(huán)境下進行。用磁鐵在燒杯底部吸附修飾Con A后的磁性納米粒子后，去掉反應(yīng)溶液，將磁性納米粒子懸浮在磷酸鹽緩沖液中，保存于4℃的冰箱中。

1.2.3 磁性納米粒子的表征

通過X射線衍射儀（X-ray diffraction，XRD）對制備的磁性納米粒子進行晶型的分析[14]，CuKα為X射線源，波長為λ=1.541 78 ?，加速電壓為50 kV。

固體樣品采用KBr壓片法制樣，通過傅里葉變換紅外光譜（fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）對制備的磁性納米粒子樣品中的非極性化學(xué)鍵進行測量[15]，測試的波數(shù)范圍為 400 cm-1～4 000 cm-1。

將不同轉(zhuǎn)速獲得的磁性納米粒子樣品噴金處理10 min后，通過掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM），加速電壓為15 kV，測定磁性納米粒子的自組裝的形態(tài)和有序程度[16]。

將不同轉(zhuǎn)速獲得的磁性納米粒子樣品通過振動磁強計（vibrating sample magnetometer，VSM）對配體修飾前后的磁性納米粒子進行測定，最大的外磁場強度為10 kOe，獲得其磁滯回線[17]。

利用激光粒度儀對不同轉(zhuǎn)速獲得的修飾Con A配體后的磁性納米粒子樣品的平均直徑進行測定。

1.2.4 磁性納米粒子對乳清中乳鐵蛋白的吸附作用

將磁性納米粒子與乳清在燒杯中混合后，吸附一定時間后，用磁鐵在燒杯底部使磁性納米粒子沉淀，棄掉乳清后，加入去離子水清洗磁性納米粒子沉淀兩次后，加入1 mol/L的NaCl進行洗脫，洗脫后用同樣的方法沉淀磁性納米粒子，將收集的洗脫液用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE） 觀察洗脫液的組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 磁性納米粒子的晶格特征

制備的磁性納米粒子中的晶格可以通過XRD來進行表征，XRD的結(jié)果見圖1。

圖1 磁性納米粒子的X衍射圖Fig.1 The XRD image of magnetic nanoparticles

從圖1可以看出，該產(chǎn)物的XRD曲線表明磁性納米粒子存在著7個特征峰，這些特征峰分別為2θ=18.5°（111）、2θ=30.1°（220）、2θ=32.3°（311）、2θ =43.2°（400）、2θ=54.1°（422）、2θ=57.5°（511）以及 2θ=62.6°（440），這些特征峰均為Fe3O4晶體的特征峰，這與Niu等[18]報道的Fe3O4磁性納米粒子特征峰一致，證明合成的磁性納米粒子為Fe3O4。

2.2 磁性納米粒子的FT-IR分析

傅里葉紅外光譜可以用于樣品中特定官能團、組成和化學(xué)結(jié)構(gòu)等的檢測，對于官能團的檢測具有很高的精確度以及分辨率。磁性納米粒子的FT-IR結(jié)果如圖2所示。

從圖2中可以看出，在579 cm-1位置的對應(yīng)峰為Fe3O4中的Fe-O鍵的伸縮振動，具有Fe3O4的典型特征。這與Safarik報道的結(jié)果一致[19]，同樣證明了采用共沉淀法制備的磁性納米粒子為Fe3O4。

2.3 磁性納米粒子形貌分析

采用掃描電鏡SEM考察不同攪拌速度對磁性納米粒子表面形貌的影響，一些具有代表性的SEM圖見圖3。

從圖3A可以看出，轉(zhuǎn)速為100 r/min所制得的磁性納米粒子的形態(tài)不規(guī)則，從橢球形到不規(guī)則形態(tài)都存在，沒有較為一致的形貌，而且磁性納米粒子的粒徑分布極其不均勻；從圖3B中可以看出，轉(zhuǎn)速為200 r/min所制得的磁性納米粒子的形態(tài)比圖3A中所制得的磁性納米粒子的形態(tài)要規(guī)則的多，絕大多數(shù)的磁性納米粒子呈現(xiàn)出橢球形。

圖2 磁性納米粒子的FTIR圖Fig.2 FTIR spectra of magnetic nanoparticles

圖3 磁性納米粒子形貌的掃描電鏡圖Fig.3 SEM images of morphology of magnetic nanoparticles

2.4 修飾配體后磁性納米粒子的平均粒徑

利用激光粒度儀對修飾配體后的磁性納米粒子的平均粒徑進行測定，其結(jié)果表明，轉(zhuǎn)速為100 r/min和200 r/min修飾Con A后的磁性納米粒子的平均粒徑為（82.49±20.34）nm 和（9.77±0.02）nm。結(jié)合 SEM圖的比例尺觀察，其粒徑大小相差幾乎是10倍。

2.5 磁性納米粒子磁滯回線

通常講，磁性納米粒子的粒徑越小，納米粒子的小尺寸效應(yīng)越明顯，即磁性性能與宏觀產(chǎn)物的大小有明顯的區(qū)別。通過振動樣品磁強計在室溫下對不同轉(zhuǎn)速獲得的磁性納米粒子進行磁性強度的測定，測得的磁滯回線見圖4。

圖4 Fe3O4磁性納米粒子的磁滯回線Fig.4 Hysteresis loop of Fe3O4magnetic nanoparticles

由圖4可以看出，在轉(zhuǎn)速為100 r/min的機械攪拌 下所制得的磁性納米粒子的磁強度為3.68 emu/g，而轉(zhuǎn)速為200 r/min所獲得的磁性納米粒子的磁強度為5.36 emu/g。200 r/min比100 r/min所獲得的磁性納米粒子的磁強度提高了45.65%。不同轉(zhuǎn)速獲得的磁性納米粒子都具有超順磁性。此外，在外加磁場存在的情況下，F(xiàn)e3O4磁性納米粒子具有明顯的磁響應(yīng)性，其結(jié)果見圖5。

圖5 Fe3O4磁性納米粒子磁性響應(yīng)圖Fig.5 The images of Fe3O4magnetic nanoparticles under an external magnetic field

從圖5A可以看出，在沒有外源磁場存在的情況下，磁性納米粒子均勻的分散于水溶液中，說明其具有良好的分散性。從圖5B中可以開出，在有外源磁場存在的情況下，磁性納米粒子都集中在外加磁鐵處，說明磁性納米粒子具有很好的超順磁性和磁相應(yīng)性。這與zhang等[20]研究Fe3O4磁性納米粒子的磁性相應(yīng)的趨勢一致。

2.6 磁性納米粒子回收脫脂乳中乳鐵蛋白的專一性

兩種粒徑的磁性納米粒子從脫脂乳中回收乳鐵蛋白的效果見圖6。

從圖6可以看出，不同粒徑的磁性納米粒子都可以從脫脂乳中回收得到乳鐵蛋白，圖6A中E1～E3有一條帶與乳鐵蛋白標(biāo)準品的位置一致，說明該蛋白為乳鐵蛋白，另外還有一些其他蛋白出現(xiàn)，通過灰度分析得知乳鐵蛋白大約占洗脫液中的23%。圖6B中E4～E6的吸附效果與E1～E3的趨勢一致，但是在E4～E6中乳鐵蛋白所占的比例明顯提高，經(jīng)灰度分析結(jié)果表明，乳鐵蛋白大約占洗脫液中的38%。說明粒徑小的磁性納米粒子對乳鐵蛋白的吸附效果好。

研究報道，Gao等[21]使用多巴胺作為配體，成功的合成了一種可以回收含6個組氨酸標(biāo)簽的蛋白，表面積大和良好的分散性使得磁性納米粒子可以增加蛋白質(zhì)結(jié)合能力，提高專一性。由于目標(biāo)蛋白可以有效地快速遞覆蓋在磁性納米粒子表面，這樣就減少了總體未被占據(jù)的表面吸附非目標(biāo)蛋白的因此獲得了高的特異性。200 r/min獲得的Fe3O4磁性納米粒子修飾Con A后的的平均粒徑小，僅為（9.77±0.02）nm，因此，小粒徑的磁性納米粒子被雜蛋白占據(jù)的表面比大粒徑的少，其吸附效果更好。

圖6 不同磁性納米粒子從脫脂乳中回收乳鐵蛋白的效果Fig.6 The effect of different particle size of magnetic nanoparticles on lactoferrin recovery from skimmed milk

3 結(jié)論

以共沉淀法制備磁性納米粒子，轉(zhuǎn)速為100 r/min獲得的磁性納米粒子形貌不規(guī)則、粒徑大小不一致；而轉(zhuǎn)速為200 r/min獲得的磁性納米粒子形貌規(guī)則、呈現(xiàn)橢球形并且粒徑大小均一一致、通過XRD對磁性納米粒子進行分析發(fā)現(xiàn)，磁性納米粒子具有7個屬于Fe3O4的特征峰、通過FT-IR試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在579 cm-1位置的對應(yīng)峰為Fe3O4中的Fe-O鍵的伸縮振動，判斷合成的磁性納米粒子的晶格為Fe3O4、通過VSM對磁性納米粒子進行磁強度分析發(fā)現(xiàn)，100 r/min和200 r/min獲得的磁性納米粒子的磁強度分別為3.68 emu/g和5.36 emu/g都具有超順磁性，并且在外加磁場存在的情況下，表現(xiàn)出了良好的磁響應(yīng)，將Con A修飾到磁性納米粒子表面以后，粒徑小的磁性納米粒子比粒徑大的磁性納米粒子能更有效地從脫脂乳中回收乳鐵蛋白。