（徐州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇徐州221140）

保健酒是以優(yōu)質(zhì)白酒為酒基，配以山藥、枸杞子、淫羊霍、黃芪、當(dāng)歸等，采用現(xiàn)代生物工程技術(shù)提取其有效活性物質(zhì)釀制而成，主要用于調(diào)節(jié)人體生理機(jī)能，以保健、養(yǎng)生、健體為目的，滿足消費(fèi)者對美好生活的需求[1-4]。但隨著市場經(jīng)濟(jì)競爭加劇、保健品促銷方式繁多和人們對養(yǎng)生保健的重視，一些不良廠商向保健酒中非法添加化學(xué)藥物，以達(dá)到保健、滋補(bǔ)、壯陽、強(qiáng)身等功效，其中補(bǔ)腎壯陽類保健酒是那非類藥物違規(guī)添加重災(zāi)區(qū)，國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布《關(guān)于51家保健酒、配制酒企業(yè)69種產(chǎn)品違法添加行為的通告》（2015年第45號），通告部分保健酒、配制酒生產(chǎn)企業(yè)存在違法添加他達(dá)那非、伐地那非、西地那非、硫代艾地那非、紅地那非等化學(xué)物質(zhì)，并在產(chǎn)品名稱、標(biāo)識、標(biāo)簽上明示或暗示壯陽、性保健等功能[5-7]。而這些那非類藥物通常作為臨床治療男性勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED）的處方藥物，如他達(dá)那非、伐地那非和西地那非。若誤食那非類藥物易引起一定的不良反應(yīng)，如頭痛、消化不良、肌肉疼痛、鼻塞、皮疹和視覺障礙等癥狀，尤其是心血管疾病和糖尿病患者若長期誤食甚至造成突然死亡[8-11]。為此，國家已嚴(yán)禁保健食品中違規(guī)添加。

目前那非類藥物檢測方法有高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[12-14]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）[15-17]和高效液相色譜-四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法（high performance liquid chromatography-four stage rod time-offlight tandem mass spectrometry，HPLC/Q-TOF MS）[18-20]，其中質(zhì)譜法由于檢出限低、靈敏度高而被廣泛用于那非類藥物檢測，但由于質(zhì)譜儀價格昂貴、分析成本高、專業(yè)操作復(fù)雜而難以滿足企業(yè)批量的檢測需要。本文以14種那非類藥物為分析對象，試樣經(jīng)乙腈提取后，采用二極管陣列檢測器（diode array detector，DAD）測定，建立了高效液相色譜法快速篩查保健酒中14種那非違禁藥物的分析方法；采用HPLC-MS/MS法對于可疑那非類藥物殘留的陽性保健酒進(jìn)行確證，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，以期規(guī)范那非類藥物合理使用。

表1 14種那非類藥物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息Table 1 Standard substance information of 14 kinds of nafil drug

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260型高效液相色譜儀：美國Agilent公司；LCMS-8080型液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：日本Shimadzu公司；JP-020S型超聲波清洗儀：廣州潔盟超聲波設(shè)備有限公司；MG-2200型氮吹儀：日本EYELA公司；MixPlus渦旋混合儀：合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司；mini plus純水超純水一體機(jī)、BS-224S型電子天平：德國Sartorious公司。

那非類藥物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（西地那非、高西地那非、羥基高西地那非、那莫西地那非、硫代艾地那非、紅地那非、那紅地那非、羥基紅地那非、羥基硫代紅地那非、伐地那非、偽伐地那非、乙酰伐地那非、他達(dá)那非、氨基他達(dá)那非）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司，純度均≥98.0%，其它具體信息見表1；甲醇、甲酸、乙腈、乙酸銨：色譜純，德國Merck公司；其余試劑為分析純；試驗(yàn)用水為超純水。

那非類藥物標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別稱取各那非類藥物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.1 g（精確至0.1 mg），用乙腈溶解，并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容，濃度為1.0 mg/mL。那非類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：用乙腈將標(biāo)準(zhǔn)儲備液逐級稀釋至濃度為 0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、50.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)系列混合工作液，臨用時現(xiàn)配。

1.2 液相色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse-plus C18（4.6 mm×150 mm，5μm）；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動相 A：0.1%甲酸水溶液；流動相B：0.1%甲酸乙腈溶液；流速：0.3 mL/min；檢測波長：程序可變波長掃描（見表1）；流動相梯度洗脫條件見表2。

表2 流動相洗脫梯度Table 2 Elution gradient of mobile phase

1.3 質(zhì)譜條件

電離方式：電噴霧正離子模式；檢測方式：多反應(yīng)檢測（multiple reaction monitoring，MRM）；霧化氣壓力：200 kPa；離子噴霧電壓：3 500 V；干燥氣溫度：330℃；干燥氣流速：8 L/min；定性離子對、定量離子、碎裂電壓和碰撞能量具體見表3。

表3 那非類藥物的質(zhì)譜參數(shù)Table 3 Mass spectrometric parameters of nafil drug

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取2 mL試樣于10 mL容量瓶中，加入5 mL乙腈，超聲30 min，冷卻至室溫，用乙腈定容至刻度，搖勻，上清液經(jīng)0.22 μm有機(jī)尼龍膜過濾，濾液供上機(jī)測定。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別取 0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、50.0 μg/mL 那非類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行HPLC測定，以混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并以測得試樣色譜峰面積與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較進(jìn)行定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的選擇

采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器（DAD）對14種那非類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液在190 nm～800 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外吸收色譜峰掃描，結(jié)合14種那非類藥物在不同波長掃描下的色譜峰紫外吸收情況，并為了消除基質(zhì)干擾，依據(jù)出峰時間選擇可變波長進(jìn)行檢測，經(jīng)優(yōu)化后選擇290nm和230nm為檢測波長，其中西地那非、伐地那非、偽伐地那非、乙酰伐地那非、他達(dá)那非、氨基他達(dá)那非的檢測波長選擇290 nm，高西地那非、羥基高西地那非、那莫西地那非、硫代艾地那非、紅地那非、那紅地那非、羥基紅地那非、羥基硫代紅地那非的檢測波長選擇230 nm（見表1）。以優(yōu)化的液相色譜條件對14種那非類藥物進(jìn)行HPLC測定，結(jié)果表明，14種那非類藥物可獲得良好的色譜分離效果（見圖1）。

2.2 色譜柱的選擇

以色譜柱中14種那非類藥物的分離度、峰面積、保留時間等為評估參數(shù)，研究Diamonsil C18、Agilent XDB C18、Inertsil C18、Symmetry C18、Zorbax Eclipse-plus C18等不同廠家型號的色譜柱對保健酒中14種那非類藥物的分離情況。結(jié)果顯示：在相同色譜分析條件下，采用Zorbax Eclipse-plus C18色譜分析柱時，14種那非類藥物色譜峰可有效分離，保留時間適中，且色譜峰峰型對稱、峰面積響應(yīng)值較高（見圖1）。故選擇Zorbax Eclipse-plus C18作為分析用色譜柱。

2.3 流動相的選擇

以Zorbax Eclipse-plus C18作為分析用色譜柱，研究甲醇-甲酸水、乙腈-甲酸水、甲醇-乙酸銨溶液、乙腈-乙酸銨溶液、乙腈-磷酸緩沖液等不同流動相對14種那非類藥物洗脫與分離效果。結(jié)果顯示：當(dāng)使用0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水作為流動相時，經(jīng)梯度洗脫后，14種那非類藥物可實(shí)現(xiàn)良好的分離效果，且色譜峰峰型尖銳對稱、高響應(yīng)值（見圖1），故選擇0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

在色譜純乙腈、空白保健酒中分別加入適量那非類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其終濃度依次為1.0 μg/mL（低濃度）、25.0 μg/mL（中濃度）、50.0 μg/mL（高濃度）等3種加標(biāo)濃度試樣，按本文所建HPLC法進(jìn)行測定，采用相對響應(yīng)值法計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)（Matrix Effect=B/A×100%，A為色譜純乙腈中被測那非類藥物的色譜峰響應(yīng)值，B為空白保健酒中被測那非類藥物的色譜峰響應(yīng)值）。結(jié)果顯示：在色譜純乙腈和空白保健酒兩種不同基質(zhì)試樣中，14種被測那非類藥物的基質(zhì)效應(yīng)在92.0%～103.6%之間，平均值為96.2%，沒有顯著的基質(zhì)效應(yīng)（見表4）。

圖1 14種那非類藥物標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatogram of 14 kinds of nafil drug

表4 基質(zhì)效應(yīng)Table 4 Matrix effect %

2.5 質(zhì)譜確證條件的優(yōu)化

由于保健酒大多數(shù)是一種中藥復(fù)方的酒劑，中藥材配料越多，基質(zhì)成分越復(fù)雜，采用HPLC測定基質(zhì)復(fù)雜的保健酒中那非類藥物非法添加可能會出現(xiàn)假陽性檢測結(jié)果。為了保障本文所建HPLC法測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，采用HPLC-MS/MS法對于可疑那非類藥物殘留的陽性保健酒進(jìn)行進(jìn)一步確證（見圖2）。結(jié)果顯示：在電噴霧正離子模式下，采用蠕動泵將1.0 μg/mL 14種那非類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液注入質(zhì)譜檢測器中均可獲得響應(yīng)信號較高的[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰（母離子）；優(yōu)化碎裂電壓和碰撞能量進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)裂解，獲得響應(yīng)信號穩(wěn)定的碎片離子峰（子離子），14種那非類藥物的母離子、定量離子、定性離子具體見表3。

2.6 線性關(guān)系和檢出限

取基質(zhì)相同的空白保健酒試樣，依次加入適量那非類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液使其質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、50.0 μg/mL，按照本文所建 HPLC 法進(jìn)行測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：14種那非類藥物在0.5 μg/mL～50.0 μg/mL范圍內(nèi)，那非類藥物質(zhì)量濃度（x）與其色譜峰峰面積（y）呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù) r2在 0.999 1～0.999 9之間（見表5）。

在空白試樣中添加一系列低濃度的那非類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，以信噪比S/N=3計(jì)算方法檢出限（limit of detection，LOD），以信噪比S/N=10計(jì)算方法定量限（limit of quantitation，LOQ）。結(jié)果表明：LOD 在0.06 μg/mL～0.24 μg/mL 之 間，LOQ 在 0.20 μg/mL ～0.80μg/mL之間（見表5）。

2.7 回收率和精密度

在空白保健酒中分別加入適量那非類藥物混標(biāo)，使其終濃度依次為 1.0 μg/mL（低濃度）、50.0 μg/mL（中濃度）、100.0μg/mL（高濃度）等 3種加標(biāo)水平，按照本文所建HPLC法進(jìn)行回收率和精密度試驗(yàn)（表6）。從表6中可知：在加標(biāo)濃度5.0mg/kg～50.0mg/kg范圍內(nèi)，保健酒種14種那非類藥物平均加標(biāo)回收率為94.1%～101.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.1%～3.7%。

圖2 14種那非類藥物總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatograms of 14 kinds of nafil drug

表5 線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 5 Linear equations，correlation coefficients，detection limits and quantitation limits

2.8 實(shí)際樣品的檢測

隨機(jī)選購市售10份保健酒，按照本文所建HPLC法進(jìn)行14種那非類藥物非法添加快速篩查種類及其含量。結(jié)果顯示：10份保健酒中檢出那非類藥物陽性試樣3份，陽性檢出率為30%；西地那非、他達(dá)那非檢出率最高，其中西地那非添加量最高達(dá)218.3 mg/mL（見表7），這可能是由于西地那非是當(dāng)前市場上流行的治療勃起功能障礙的口服速效處方藥，且價格低廉，質(zhì)量有保證，故被不良廠商非法添加到保健酒種，以達(dá)到速效、高效的保健、滋補(bǔ)、壯陽、強(qiáng)身等功能宣稱廣告目的，從而進(jìn)一步拓展銷路而非法牟利。

表7 實(shí)際樣品的檢測Table 7 Detection of actual samples

續(xù)表7 實(shí)際樣品的檢測Continue table 7 Detection of actual samples

3 結(jié)論

保健酒中的非法添加問題亟待解決，而保健酒的檢測分析是保證和提高品質(zhì)的首要任務(wù)。本研究以14種那非類藥物為分析對象，試樣經(jīng)乙腈提取后，采用二極管陣列檢測器（DAD）測定，建立了高效液相色譜法快速篩查保健酒中14種那非違禁藥物的分析方法；采用HPLC-MS/MS法對于可疑那非類藥物殘留的陽性保健酒進(jìn)行進(jìn)一步確證。結(jié)果表明：在0.5 μg/mL～50.0 μg/mL范圍內(nèi)，14種那非類藥物質(zhì)量濃度與其峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r2在0.999 1～0.999 9 之間；LOD 在 0.06 μg/mL～0.24 μg/mL，LOQ 在0.20μg/mL～0.80μg/mL；平均回收率在94.1%～101.4%，RSD在1.1%～3.7%。該HPLC法測定保健酒中14種那非類藥物具有操作簡單、回收率高、精密度好、檢出限低等優(yōu)點(diǎn)，可為保健酒中那非類藥物非法添加監(jiān)督管理提供檢測技術(shù)，有效規(guī)范保健酒行業(yè)健康發(fā)展。