長(zhǎng)白山野生松針?lè)劭寡趸翱顾ダ献饔玫难芯?/h1>
2018-08-24 07:09:48孟永海懷雪翟春梅李廷利卞宏生馬智超孟祥瑛王艷艷
食品研究與開(kāi)發(fā) 2018年17期
孟永海，懷雪，翟春梅，李廷利，卞宏生，馬智超，孟祥瑛，王艷艷，，*
（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥理實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150040）
松針（pineneedle）為松科松屬植物的葉，別名豬鬃松葉、松毛、山松須[1]。松針歷史悠久，《本草綱目》記載“松針，氣味苦、溫、無(wú)毒，久服令人不老，輕身益氣，主治風(fēng)濕瘡，生發(fā)，安五臟，守中，不饑延年。松針內(nèi)富含糖類(lèi)、粗蛋白、粗脂肪、氨基酸和微量礦物元素、維生素、抗菌素、生物黃酮類(lèi)物質(zhì)、莽草酸、精油、葉綠素、木脂素、不飽和脂肪酸、酶與輔酶等營(yíng)養(yǎng)素和活性物質(zhì)，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值。松針的主要藥理活性有抗血小板聚集活性，降血脂，降血糖，鎮(zhèn)痛抗炎，祛痰及平喘，抗氧化，抗腫瘤，抗病毒，抗菌，抗突變效應(yīng)，抗疲勞等藥理作用[2]。其活性成分和藥理作用決定了松針在食品保健方面的特殊性。早在上世紀(jì)90年代，將松葉的有效成分溶解于貴釀酒中，使該酒具有護(hù)肝、延緩衰老、降壓利尿等功效[3]。近年來(lái)，松針開(kāi)發(fā)成含維生素C、維生素B1、維生素B2等對(duì)人體保健大有益處的松針飲料，具有潤(rùn)肺益氣，除風(fēng)止痛的松針茶，用松脂提取的天然香料等[4]。本文以衰老小鼠和果蠅為生物模式，對(duì)長(zhǎng)白山野生松針的抗氧化及抗衰老作用進(jìn)行研究，為其功能食品的研發(fā)提供理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 動(dòng)物
美國(guó)癌癥研究所（Institute of Cancer Research，ICR）雄性小鼠10只，ICR雄性老齡鼠20只，體重（20±2）g：均由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全評(píng)價(jià)中心提供；野生型Canton S品系黑腹果蠅：由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院果蠅技術(shù)平臺(tái)提供。
1.2 試劑與儀器
松針：產(chǎn)自吉林長(zhǎng)白山；MDA試劑盒、SOD試劑盒、BCA試劑盒、GSH試劑盒（批號(hào)均為20170809）：南京建成生物研究所；FJ-200高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：上海申勝儀器公司；HH.WZ.CY600電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司；CT15RE高速冷凍離心機(jī)：日本HITACHI公司；AL 204電子天平：美國(guó)METTLER TOLEDO公司；EVOLUTION 260紫外分光光度計(jì)：美國(guó)THERMO公司；EPOCH12酶標(biāo)儀：美國(guó)BIOTEK公司。
2 試驗(yàn)方法
2.1 小鼠抗氧化實(shí)驗(yàn)
選取ICR青年與老年小鼠30只，按照文獻(xiàn)方法加以改進(jìn)[5]，分3組即老年給藥組、老年模型組、青年對(duì)照組。松針?lè)鬯檫^(guò)篩，按照散劑配制[6]，給藥劑量為5 g/kg，給藥30 d。老年模型組、青年對(duì)照組給等體積的生理鹽水。末次給藥后，眼球取血，低溫離心，硫代巴比妥酸法測(cè)定血清中丙二醛（malondialdehyde，MDA）、羥胺法測(cè)定血清中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的含量。冰上取肝組織，微板法測(cè)定肝組織中蛋白定量（bicinchoninic acid，BCA）[2]、比色法測(cè)定谷胱甘肽（glutathion，GSH）的含量。
2.2 果蠅壽命的實(shí)驗(yàn)
果蠅培養(yǎng)基的制備采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方：蒸餾水46 mL，玉米粉 4.2 g，蔗糖 3.1 g，瓊脂 0.3 g，在培養(yǎng)基中添加不同劑量（高1.845%、中0.461%、低0.115%）的松針?lè)郏瑢?duì)照組則給予正常培養(yǎng)基飼養(yǎng)。煮沸至糊狀，停止加熱，待溫度降至60℃～70℃時(shí)，加入酵母粉0.3 g，攪拌均勻，加入丙酸0.3 mL，攪拌均勻，立即分裝至果蠅管中。參照文獻(xiàn)方法加以改進(jìn)[7-9]，對(duì)果蠅行為學(xué)進(jìn)行考察。
2.2.1 壽命實(shí)驗(yàn)
收集12 h內(nèi)羽化成蟲(chóng)的果蠅，隨機(jī)分為對(duì)照組和給藥組，每組雌雄各100只，在（25±4）℃、相對(duì)濕度為（60±10）%、光/暗時(shí)間為12 h/12 h的恒溫恒濕智能培養(yǎng)室中培樣。每4天更換一次培養(yǎng)基并觀察記錄果蠅的情況。計(jì)算平均壽命，中間壽命，最高壽命。
2.2.2 亞急性氧化損傷實(shí)驗(yàn)
取30日齡果蠅，每組雌雄各100只，果蠅饑餓兩小時(shí)后分別給予含20%的H2O2的6%的葡萄糖溶液，每4小時(shí)記錄一次，直至果蠅全部死亡。
2.2.3 衰老果蠅的攀爬實(shí)驗(yàn)
收集12 h內(nèi)羽化成蟲(chóng)的果蠅，每組10只果蠅，雌雄各半。于第0、10、20、30天移入空的果蠅管中，觀察10 s內(nèi)攀爬超過(guò)8 cm處的果蠅只數(shù)。每組重復(fù)實(shí)驗(yàn)5次。
2.2.4 對(duì)果蠅體內(nèi)水分含量的影響
收集12 h內(nèi)羽化成蟲(chóng)的果蠅，每組雌雄各50只，飼養(yǎng)至30 d，稱(chēng)初重，放入干燥箱中（55℃），1 h后再次稱(chēng)重，兩次重量差即為果蠅體內(nèi)水分含量。每組重復(fù)實(shí)驗(yàn)4次。
2.2.5 生殖實(shí)驗(yàn)
分別取7、15、30 d蠅，每管雌雄各一只，飼養(yǎng)3 d后取出，記錄第1天出生的子代蠅個(gè)數(shù)，連續(xù)記錄7 d，每組實(shí)驗(yàn)平行6次。
2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
運(yùn)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析（analysis of variance，ANOVA）單因素方差分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間做t檢驗(yàn)，P<0.05則表示有顯著性差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為極顯著性差異。（果蠅實(shí)驗(yàn)中，給藥組雌果蠅與空白對(duì)照組雌果蠅比較，雄果蠅與空白對(duì)照組雄果蠅比較）。
3 結(jié)果
3.1 小鼠血清SOD、MDA含量以及肝組織GSH含量
小鼠血清SOD、MDA及肝組織GSH含量見(jiàn)表1。
表1 小鼠血清SOD、MDA及肝組織GSH含量（n=10）Table 1 The content of SOD，MDA，and liver homogenate GSH in mice（n=10）
與老年模型組相比，青年對(duì)照組MDA、SOD及肝組織GSH含量均有極顯著差異（P<0.01），說(shuō)明正常生理下衰老小鼠與青年小鼠相比，衰老指標(biāo)發(fā)生明顯變化。但老年給藥組SOD和GSH含量與老年模型組相比，有顯著性差異（P<0.05），MDA含量雖無(wú)顯著性差異，但有降低趨勢(shì)。這可能與給藥時(shí)間不足有關(guān)。此實(shí)驗(yàn)表明，給與一定劑量的松針?lè)?，可回調(diào)衰老小鼠的抗氧化指標(biāo)，有一定的延緩衰老的效果。
3.2 松針?lè)蹖?duì)果蠅壽命相關(guān)行為學(xué)指標(biāo)考察結(jié)果
3.2.1 松針?lè)蹖?duì)果蠅壽命的影響
松針?lè)蹖?duì)果蠅壽命的影響見(jiàn)表2。
與果蠅空白對(duì)照組相比，各給藥組的果蠅平均壽命和最長(zhǎng)壽命，均有不同程度的延長(zhǎng)，與對(duì)照組相比，各給藥組雌雄果蠅平均壽命均呈現(xiàn)極顯著差異（P<0.01），中、低劑量組雌雄果蠅的最長(zhǎng)壽命也呈現(xiàn)極顯著性差異（P<0.01）。說(shuō)明果蠅終身補(bǔ)充一定劑量的松針?lè)郏裳娱L(zhǎng)自身壽命。
果蠅壽命存活率見(jiàn)圖1。
表2 松針?lè)蹖?duì)果蠅壽命的影響（n=100）Table 2 Lifespan parameters in drosophila following pine supplement（n=100）
圖1 果蠅壽命存活率折線(xiàn)圖（n=100）Fig.1 Graph of drosophila melanogaster’s survival rate（n=100）
3.2.2 松針?lè)蹖?duì)果蠅亞急性氧化損傷實(shí)驗(yàn)
松針?lè)蹖?duì)果蠅亞急性氧化損傷的作用見(jiàn)表3。
在亞急性氧化損傷實(shí)驗(yàn)中，與空白對(duì)照組相比高劑量組雌雄平均存活時(shí)間呈現(xiàn)極顯著性差異（P<0.01）；中劑量組雌雄果蠅呈現(xiàn)顯著性差異（P<0.05）；低劑量組均無(wú)顯著性差異。
3.2.3 松針?lè)蹖?duì)不同時(shí)期果蠅的攀爬活動(dòng)的影響
松針?lè)蹖?duì)不同時(shí)期果蠅的攀爬活動(dòng)的影響見(jiàn)表4。
表3 松針?lè)蹖?duì)果蠅亞急性氧化損傷的作用（n=100）Table 3 Survival time parameters in drosophila exposed to H2O2 following pine supplement（n=100）
表4 松針?lè)蹖?duì)不同時(shí)期果蠅的攀爬活動(dòng)的影響（n=5）Table 4 Climbing ability in drosophila following pine supplement（n=5）
與空白對(duì)照組相比，各給藥組10日齡雄果蠅的攀爬能力有極顯著性差異（P<0.01），低劑量組雌果蠅攀爬能力顯著增加（P<0.05）；高、中劑量給藥組20日齡雄果蠅的攀爬能力顯著增加（P<0.05或P<0.01），中劑量組雌果蠅的攀爬能力有極顯著性差異（P<0.01）；高劑量組30日雄果蠅的攀爬能力有極顯著性差異（P<0.01）。果蠅攀爬實(shí)驗(yàn)折線(xiàn)圖見(jiàn)圖2。
3.2.4 松針?lè)蹖?duì)果蠅體內(nèi)水分含量的影響
松針?lè)蹖?duì)果蠅體內(nèi)含水量的影響見(jiàn)表5。
圖2 果蠅攀爬實(shí)驗(yàn)折線(xiàn)圖Fig.2 Climbing ability in drosophila following pine supplement
表5 松針?lè)蹖?duì)果蠅體內(nèi)含水量的影響（n=4）Table 5 Detection of water content in drosophila in each group（n=4）
與空白對(duì)照組相比，高劑量組體內(nèi)水分含量無(wú)顯著性差異；中劑量組呈現(xiàn)極顯著差異（P<0.01）；低劑量組雄果蠅與對(duì)照組相比，有顯著性差異（P<0.05）；研究發(fā)現(xiàn)各組雌果蠅的體內(nèi)含水量明顯高于雄果蠅。
3.2.5 松針?lè)蹖?duì)果蠅繁殖能力的影響
松針?lè)蹖?duì)果蠅繁殖能力的影響見(jiàn)圖3。
圖3 不同日齡果蠅繁殖果蠅數(shù)統(tǒng)計(jì)Fig.3 Reproduction parameters in drosophila following pine supplement
與空白對(duì)照組相比，各階段高劑量組果蠅子代個(gè)數(shù)減少，中劑量組果蠅子代數(shù)增加（P<0.05或P<0.01），低劑量組30 d果蠅的子代數(shù)有顯著差異（P<0.01）。值得注意的是，隨著日齡增加對(duì)照組果蠅子代數(shù)呈降低趨勢(shì)，而終生補(bǔ)充低劑量松針?lè)鄣墓夒S著日齡增加，果蠅子代數(shù)呈上升趨勢(shì)，尤以30日齡的果蠅產(chǎn)的子代數(shù)最多，可見(jiàn)終生低劑量補(bǔ)充松針?lè)劭纱蟠筇岣呃夏陼r(shí)期生物的繁殖能力，功效明顯。
4 討論
清除自由基延緩衰老[10]的學(xué)說(shuō)被越來(lái)越多人認(rèn)可，衰老過(guò)程中自由基促成的脂質(zhì)過(guò)氧化作用亦隨齡增高[11]，SOD是存在于生物體內(nèi)的抗氧化酶系，能有效地清除細(xì)胞代謝過(guò)程中產(chǎn)生的氧自由基[12]，GSH可以認(rèn)為是生物體內(nèi)氧自由基消除系統(tǒng)的重要防線(xiàn)，主要起保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的作用[13]。細(xì)胞中的脂類(lèi)物質(zhì)受到氧自由基作用時(shí)，發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生一些分解產(chǎn)物如MDA等。MDA作為機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的最終代謝產(chǎn)物，其高低又間接反應(yīng)了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度[14-15]。
檢測(cè)動(dòng)物的壽命是目前研究老齡化和抗老齡化中應(yīng)用普通、較有權(quán)威的試驗(yàn)手段之一，果蠅這種模式生物[16]用于壽命實(shí)驗(yàn)的先進(jìn)性和機(jī)理探討的優(yōu)勢(shì)較為明顯，其優(yōu)點(diǎn)在于生命周期短、繁殖力強(qiáng)[17]，遺傳背景清晰又具有相對(duì)簡(jiǎn)單的腦[18]，有方便的遺傳學(xué)工具[19]，且基因組小[20]，易于分析操作。
小鼠抗氧化實(shí)驗(yàn)中老年給藥組與老年模型組相比，MDA含量略降低，SOD、GSH含量明顯升高，說(shuō)明松針?lè)蹖?duì)老齡小鼠有一定的抗氧化效果。影響果蠅壽命存在多種因素[21-22]，在盡可能保證外界因素一致的情況下進(jìn)行果蠅壽命實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)松針可顯著性延長(zhǎng)各個(gè)給藥濃度的雌雄果蠅壽命。大量文獻(xiàn)已報(bào)道松針具有體外抗氧化能力[23-25]，在果蠅培養(yǎng)基中添加不同濃度松針?lè)畚桂B(yǎng)30 d后，進(jìn)行氧化損傷實(shí)驗(yàn)中，隨著藥物濃度的增加與果蠅平均存活時(shí)間成正相關(guān)，說(shuō)明松針不僅在體外有一定的抗氧化作用，而且在動(dòng)物體內(nèi)也有顯著的抗亞急性氧化損傷效果。運(yùn)動(dòng)和衰老息息相關(guān)[26]，利用正常果蠅具有反趨地性行為的特性進(jìn)行攀爬測(cè)試[27]，松針?lè)劭梢蕴岣吆透纳评夏旯壍呐逝肋\(yùn)動(dòng)能力，增加老年果蠅體內(nèi)含水量，改善果蠅物質(zhì)代謝與能量代謝。中、低濃度的松針?lè)圻€可增加果蠅的子代數(shù)，這些實(shí)驗(yàn)說(shuō)明松針?lè)劭赏ㄟ^(guò)提高機(jī)體抗氧化能力而抗衰老，其機(jī)理可能與其提高抗氧化酶的活性及其抑制脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生等一系列抗氧化作用密切相關(guān)。其分子機(jī)制有待深入研究，它必將在如今老齡化社會(huì)發(fā)揮更大作用。
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松針（pineneedle）為松科松屬植物的葉，別名豬鬃松葉、松毛、山松須[1]。松針歷史悠久，《本草綱目》記載“松針，氣味苦、溫、無(wú)毒，久服令人不老，輕身益氣，主治風(fēng)濕瘡，生發(fā)，安五臟，守中，不饑延年。松針內(nèi)富含糖類(lèi)、粗蛋白、粗脂肪、氨基酸和微量礦物元素、維生素、抗菌素、生物黃酮類(lèi)物質(zhì)、莽草酸、精油、葉綠素、木脂素、不飽和脂肪酸、酶與輔酶等營(yíng)養(yǎng)素和活性物質(zhì)，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值。松針的主要藥理活性有抗血小板聚集活性，降血脂，降血糖，鎮(zhèn)痛抗炎，祛痰及平喘，抗氧化，抗腫瘤，抗病毒，抗菌，抗突變效應(yīng)，抗疲勞等藥理作用[2]。其活性成分和藥理作用決定了松針在食品保健方面的特殊性。早在上世紀(jì)90年代，將松葉的有效成分溶解于貴釀酒中，使該酒具有護(hù)肝、延緩衰老、降壓利尿等功效[3]。近年來(lái)，松針開(kāi)發(fā)成含維生素C、維生素B1、維生素B2等對(duì)人體保健大有益處的松針飲料，具有潤(rùn)肺益氣，除風(fēng)止痛的松針茶，用松脂提取的天然香料等[4]。本文以衰老小鼠和果蠅為生物模式，對(duì)長(zhǎng)白山野生松針的抗氧化及抗衰老作用進(jìn)行研究，為其功能食品的研發(fā)提供理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 動(dòng)物
美國(guó)癌癥研究所（Institute of Cancer Research，ICR）雄性小鼠10只，ICR雄性老齡鼠20只，體重（20±2）g：均由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全評(píng)價(jià)中心提供；野生型Canton S品系黑腹果蠅：由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院果蠅技術(shù)平臺(tái)提供。
1.2 試劑與儀器
松針：產(chǎn)自吉林長(zhǎng)白山；MDA試劑盒、SOD試劑盒、BCA試劑盒、GSH試劑盒（批號(hào)均為20170809）：南京建成生物研究所；FJ-200高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：上海申勝儀器公司；HH.WZ.CY600電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司；CT15RE高速冷凍離心機(jī)：日本HITACHI公司；AL 204電子天平：美國(guó)METTLER TOLEDO公司；EVOLUTION 260紫外分光光度計(jì)：美國(guó)THERMO公司；EPOCH12酶標(biāo)儀：美國(guó)BIOTEK公司。
2 試驗(yàn)方法
2.1 小鼠抗氧化實(shí)驗(yàn)
選取ICR青年與老年小鼠30只，按照文獻(xiàn)方法加以改進(jìn)[5]，分3組即老年給藥組、老年模型組、青年對(duì)照組。松針?lè)鬯檫^(guò)篩，按照散劑配制[6]，給藥劑量為5 g/kg，給藥30 d。老年模型組、青年對(duì)照組給等體積的生理鹽水。末次給藥后，眼球取血，低溫離心，硫代巴比妥酸法測(cè)定血清中丙二醛（malondialdehyde，MDA）、羥胺法測(cè)定血清中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的含量。冰上取肝組織，微板法測(cè)定肝組織中蛋白定量（bicinchoninic acid，BCA）[2]、比色法測(cè)定谷胱甘肽（glutathion，GSH）的含量。
2.2 果蠅壽命的實(shí)驗(yàn)
果蠅培養(yǎng)基的制備采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方：蒸餾水46 mL，玉米粉 4.2 g，蔗糖 3.1 g，瓊脂 0.3 g，在培養(yǎng)基中添加不同劑量（高1.845%、中0.461%、低0.115%）的松針?lè)郏瑢?duì)照組則給予正常培養(yǎng)基飼養(yǎng)。煮沸至糊狀，停止加熱，待溫度降至60℃～70℃時(shí)，加入酵母粉0.3 g，攪拌均勻，加入丙酸0.3 mL，攪拌均勻，立即分裝至果蠅管中。參照文獻(xiàn)方法加以改進(jìn)[7-9]，對(duì)果蠅行為學(xué)進(jìn)行考察。
2.2.1 壽命實(shí)驗(yàn)
收集12 h內(nèi)羽化成蟲(chóng)的果蠅，隨機(jī)分為對(duì)照組和給藥組，每組雌雄各100只，在（25±4）℃、相對(duì)濕度為（60±10）%、光/暗時(shí)間為12 h/12 h的恒溫恒濕智能培養(yǎng)室中培樣。每4天更換一次培養(yǎng)基并觀察記錄果蠅的情況。計(jì)算平均壽命，中間壽命，最高壽命。
2.2.2 亞急性氧化損傷實(shí)驗(yàn)
取30日齡果蠅，每組雌雄各100只，果蠅饑餓兩小時(shí)后分別給予含20%的H2O2的6%的葡萄糖溶液，每4小時(shí)記錄一次，直至果蠅全部死亡。
2.2.3 衰老果蠅的攀爬實(shí)驗(yàn)
收集12 h內(nèi)羽化成蟲(chóng)的果蠅，每組10只果蠅，雌雄各半。于第0、10、20、30天移入空的果蠅管中，觀察10 s內(nèi)攀爬超過(guò)8 cm處的果蠅只數(shù)。每組重復(fù)實(shí)驗(yàn)5次。
2.2.4 對(duì)果蠅體內(nèi)水分含量的影響
收集12 h內(nèi)羽化成蟲(chóng)的果蠅，每組雌雄各50只，飼養(yǎng)至30 d，稱(chēng)初重，放入干燥箱中（55℃），1 h后再次稱(chēng)重，兩次重量差即為果蠅體內(nèi)水分含量。每組重復(fù)實(shí)驗(yàn)4次。
2.2.5 生殖實(shí)驗(yàn)
分別取7、15、30 d蠅，每管雌雄各一只，飼養(yǎng)3 d后取出，記錄第1天出生的子代蠅個(gè)數(shù)，連續(xù)記錄7 d，每組實(shí)驗(yàn)平行6次。
2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
運(yùn)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析（analysis of variance，ANOVA）單因素方差分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間做t檢驗(yàn)，P<0.05則表示有顯著性差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為極顯著性差異。（果蠅實(shí)驗(yàn)中，給藥組雌果蠅與空白對(duì)照組雌果蠅比較，雄果蠅與空白對(duì)照組雄果蠅比較）。
3 結(jié)果
3.1 小鼠血清SOD、MDA含量以及肝組織GSH含量
小鼠血清SOD、MDA及肝組織GSH含量見(jiàn)表1。
表1 小鼠血清SOD、MDA及肝組織GSH含量（n=10）Table 1 The content of SOD，MDA，and liver homogenate GSH in mice（n=10）
與老年模型組相比，青年對(duì)照組MDA、SOD及肝組織GSH含量均有極顯著差異（P<0.01），說(shuō)明正常生理下衰老小鼠與青年小鼠相比，衰老指標(biāo)發(fā)生明顯變化。但老年給藥組SOD和GSH含量與老年模型組相比，有顯著性差異（P<0.05），MDA含量雖無(wú)顯著性差異，但有降低趨勢(shì)。這可能與給藥時(shí)間不足有關(guān)。此實(shí)驗(yàn)表明，給與一定劑量的松針?lè)?，可回調(diào)衰老小鼠的抗氧化指標(biāo)，有一定的延緩衰老的效果。
3.2 松針?lè)蹖?duì)果蠅壽命相關(guān)行為學(xué)指標(biāo)考察結(jié)果
3.2.1 松針?lè)蹖?duì)果蠅壽命的影響
松針?lè)蹖?duì)果蠅壽命的影響見(jiàn)表2。
與果蠅空白對(duì)照組相比，各給藥組的果蠅平均壽命和最長(zhǎng)壽命，均有不同程度的延長(zhǎng)，與對(duì)照組相比，各給藥組雌雄果蠅平均壽命均呈現(xiàn)極顯著差異（P<0.01），中、低劑量組雌雄果蠅的最長(zhǎng)壽命也呈現(xiàn)極顯著性差異（P<0.01）。說(shuō)明果蠅終身補(bǔ)充一定劑量的松針?lè)郏裳娱L(zhǎng)自身壽命。
果蠅壽命存活率見(jiàn)圖1。
表2 松針?lè)蹖?duì)果蠅壽命的影響（n=100）Table 2 Lifespan parameters in drosophila following pine supplement（n=100）
圖1 果蠅壽命存活率折線(xiàn)圖（n=100）Fig.1 Graph of drosophila melanogaster’s survival rate（n=100）
3.2.2 松針?lè)蹖?duì)果蠅亞急性氧化損傷實(shí)驗(yàn)
松針?lè)蹖?duì)果蠅亞急性氧化損傷的作用見(jiàn)表3。
在亞急性氧化損傷實(shí)驗(yàn)中，與空白對(duì)照組相比高劑量組雌雄平均存活時(shí)間呈現(xiàn)極顯著性差異（P<0.01）；中劑量組雌雄果蠅呈現(xiàn)顯著性差異（P<0.05）；低劑量組均無(wú)顯著性差異。
3.2.3 松針?lè)蹖?duì)不同時(shí)期果蠅的攀爬活動(dòng)的影響
松針?lè)蹖?duì)不同時(shí)期果蠅的攀爬活動(dòng)的影響見(jiàn)表4。
表3 松針?lè)蹖?duì)果蠅亞急性氧化損傷的作用（n=100）Table 3 Survival time parameters in drosophila exposed to H2O2 following pine supplement（n=100）
表4 松針?lè)蹖?duì)不同時(shí)期果蠅的攀爬活動(dòng)的影響（n=5）Table 4 Climbing ability in drosophila following pine supplement（n=5）
與空白對(duì)照組相比，各給藥組10日齡雄果蠅的攀爬能力有極顯著性差異（P<0.01），低劑量組雌果蠅攀爬能力顯著增加（P<0.05）；高、中劑量給藥組20日齡雄果蠅的攀爬能力顯著增加（P<0.05或P<0.01），中劑量組雌果蠅的攀爬能力有極顯著性差異（P<0.01）；高劑量組30日雄果蠅的攀爬能力有極顯著性差異（P<0.01）。果蠅攀爬實(shí)驗(yàn)折線(xiàn)圖見(jiàn)圖2。
3.2.4 松針?lè)蹖?duì)果蠅體內(nèi)水分含量的影響
松針?lè)蹖?duì)果蠅體內(nèi)含水量的影響見(jiàn)表5。
圖2 果蠅攀爬實(shí)驗(yàn)折線(xiàn)圖Fig.2 Climbing ability in drosophila following pine supplement
表5 松針?lè)蹖?duì)果蠅體內(nèi)含水量的影響（n=4）Table 5 Detection of water content in drosophila in each group（n=4）
與空白對(duì)照組相比，高劑量組體內(nèi)水分含量無(wú)顯著性差異；中劑量組呈現(xiàn)極顯著差異（P<0.01）；低劑量組雄果蠅與對(duì)照組相比，有顯著性差異（P<0.05）；研究發(fā)現(xiàn)各組雌果蠅的體內(nèi)含水量明顯高于雄果蠅。
3.2.5 松針?lè)蹖?duì)果蠅繁殖能力的影響
松針?lè)蹖?duì)果蠅繁殖能力的影響見(jiàn)圖3。
圖3 不同日齡果蠅繁殖果蠅數(shù)統(tǒng)計(jì)Fig.3 Reproduction parameters in drosophila following pine supplement
與空白對(duì)照組相比，各階段高劑量組果蠅子代個(gè)數(shù)減少，中劑量組果蠅子代數(shù)增加（P<0.05或P<0.01），低劑量組30 d果蠅的子代數(shù)有顯著差異（P<0.01）。值得注意的是，隨著日齡增加對(duì)照組果蠅子代數(shù)呈降低趨勢(shì)，而終生補(bǔ)充低劑量松針?lè)鄣墓夒S著日齡增加，果蠅子代數(shù)呈上升趨勢(shì)，尤以30日齡的果蠅產(chǎn)的子代數(shù)最多，可見(jiàn)終生低劑量補(bǔ)充松針?lè)劭纱蟠筇岣呃夏陼r(shí)期生物的繁殖能力，功效明顯。
4 討論
清除自由基延緩衰老[10]的學(xué)說(shuō)被越來(lái)越多人認(rèn)可，衰老過(guò)程中自由基促成的脂質(zhì)過(guò)氧化作用亦隨齡增高[11]，SOD是存在于生物體內(nèi)的抗氧化酶系，能有效地清除細(xì)胞代謝過(guò)程中產(chǎn)生的氧自由基[12]，GSH可以認(rèn)為是生物體內(nèi)氧自由基消除系統(tǒng)的重要防線(xiàn)，主要起保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的作用[13]。細(xì)胞中的脂類(lèi)物質(zhì)受到氧自由基作用時(shí)，發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生一些分解產(chǎn)物如MDA等。MDA作為機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的最終代謝產(chǎn)物，其高低又間接反應(yīng)了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度[14-15]。
檢測(cè)動(dòng)物的壽命是目前研究老齡化和抗老齡化中應(yīng)用普通、較有權(quán)威的試驗(yàn)手段之一，果蠅這種模式生物[16]用于壽命實(shí)驗(yàn)的先進(jìn)性和機(jī)理探討的優(yōu)勢(shì)較為明顯，其優(yōu)點(diǎn)在于生命周期短、繁殖力強(qiáng)[17]，遺傳背景清晰又具有相對(duì)簡(jiǎn)單的腦[18]，有方便的遺傳學(xué)工具[19]，且基因組小[20]，易于分析操作。
小鼠抗氧化實(shí)驗(yàn)中老年給藥組與老年模型組相比，MDA含量略降低，SOD、GSH含量明顯升高，說(shuō)明松針?lè)蹖?duì)老齡小鼠有一定的抗氧化效果。影響果蠅壽命存在多種因素[21-22]，在盡可能保證外界因素一致的情況下進(jìn)行果蠅壽命實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)松針可顯著性延長(zhǎng)各個(gè)給藥濃度的雌雄果蠅壽命。大量文獻(xiàn)已報(bào)道松針具有體外抗氧化能力[23-25]，在果蠅培養(yǎng)基中添加不同濃度松針?lè)畚桂B(yǎng)30 d后，進(jìn)行氧化損傷實(shí)驗(yàn)中，隨著藥物濃度的增加與果蠅平均存活時(shí)間成正相關(guān)，說(shuō)明松針不僅在體外有一定的抗氧化作用，而且在動(dòng)物體內(nèi)也有顯著的抗亞急性氧化損傷效果。運(yùn)動(dòng)和衰老息息相關(guān)[26]，利用正常果蠅具有反趨地性行為的特性進(jìn)行攀爬測(cè)試[27]，松針?lè)劭梢蕴岣吆透纳评夏旯壍呐逝肋\(yùn)動(dòng)能力，增加老年果蠅體內(nèi)含水量，改善果蠅物質(zhì)代謝與能量代謝。中、低濃度的松針?lè)圻€可增加果蠅的子代數(shù)，這些實(shí)驗(yàn)說(shuō)明松針?lè)劭赏ㄟ^(guò)提高機(jī)體抗氧化能力而抗衰老，其機(jī)理可能與其提高抗氧化酶的活性及其抑制脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生等一系列抗氧化作用密切相關(guān)。其分子機(jī)制有待深入研究，它必將在如今老齡化社會(huì)發(fā)揮更大作用。
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