李南南 孫淑珍 吳群 程西永 劉華榮 毛瑞喜 李斯深

摘要：利用52個(gè)SSR分子標(biāo)記對(duì)山東省及部分外省近年審定品種和區(qū)試品系進(jìn)行了遺傳多樣性檢測(cè)，并分析了其與主要農(nóng)藝性狀的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果表明，共檢測(cè)到150個(gè)等位位點(diǎn)，平均每對(duì)引物檢測(cè)到2.9個(gè)等位位點(diǎn)；SSR標(biāo)記多態(tài)性信息量（PIC）范圍為0.11～1.00，平均為0.51。聚類分析結(jié)果顯示，供試品種（系）共聚成3個(gè)類群，具有相同親本或同一育種單位的品種往往聚在一起。通過(guò)SSR標(biāo)記與區(qū)試品系主要農(nóng)藝性狀的關(guān)聯(lián)分析，得到與部分農(nóng)藝性狀極顯著相關(guān)（P<0.01）的標(biāo)記8個(gè)，發(fā)掘到一批與農(nóng)藝性狀相關(guān)的優(yōu)異等位變異，如與千粒重相關(guān)的等位變異wmc657-A50、增加容重的wmc322-A195和gwm292-A190，降低株高的等位變異cfd168-A105和gpw294-A80。

關(guān)鍵詞：小麥；SSR標(biāo)記；遺傳多樣性；農(nóng)藝性狀；關(guān)聯(lián)分析

中圖分類號(hào)：S512.101文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2018）05-0018-06

Abstract The genetic diversity of wheat varieties in recent years in Shandong and other provinces was detected using 52 SSR markers， and the association analysis between SSR markers and important agronomic traits was conducted. A total of 150 alleles were detected with the mean of 2.9 alleles for a single SSR marker. The range of polymorphism information content （PIC） was 0.11～1.00 with the mean of 0.51. Cluster analysis showed that the varieties could be divided into three groups， most of the varieties with the common parents or from the same breeding institutions were trend to be clustered into one group. There were eight SSR markers significantly associated with agriculture traits （P<0.01）. Some favorable alleles associated with agronomic traits in multiple environments were discovered， such as wmc657-A50 for increasing the thousand grain weight， wmc322-A195 and gwm292-A190 for improving bulk weight， cfd168-A105 and gpw294-A80 for reducing plant height.

Keywords Wheat； SSR marker； Genetic diversity； Agronomic traits； Association analysis

小麥?zhǔn)俏覈?guó)主要糧食作物之一，品種更替對(duì)于其單產(chǎn)的提升具有重要作用。豐富的遺傳多樣性是作物育種的重要基礎(chǔ)[1，2]。彭芹等[3]利用SSR引物，對(duì)1950年以來(lái)山東省主要推廣小麥品種的遺傳多樣性演變進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)山東省小麥品種遺傳多樣性以20世紀(jì)50年代最高，之后緩慢下降；80年代由于特有種質(zhì)資源的創(chuàng)造和應(yīng)用，山東省小麥品種的遺傳多樣性高于全國(guó)和其他麥區(qū)，但后來(lái)迅速下降。倪中福等[4]利用SSR標(biāo)記分析小麥D染色體組，發(fā)現(xiàn)冬小麥較春小麥群體內(nèi)存在更大的遺傳差異。

SSR標(biāo)記具有多態(tài)性高、共顯性分離、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，在關(guān)聯(lián)分析、分子標(biāo)記輔助育種、品種及基因型鑒定、QTL定位和遺傳圖譜構(gòu)建等方面發(fā)揮了重要的作用[5，6]。在遺傳多樣性分析的基礎(chǔ)上進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，有利于發(fā)掘與重要農(nóng)藝性狀有關(guān)的標(biāo)記。王升星等[7]利用SSR標(biāo)記對(duì)小麥單株產(chǎn)量及有關(guān)性狀進(jìn)行全基因組QTL分析，得到了3個(gè)控制千粒重、2個(gè)控制單株產(chǎn)量和2個(gè)控制單株有效穗數(shù)的QTL。武玉國(guó)等[8]對(duì)SSR標(biāo)記與黃淮冬麥區(qū)小麥品種的主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，得到了與小穗數(shù)、千粒重緊密相關(guān)的標(biāo)記。劉新倫等[9] 通過(guò)SSR標(biāo)記與小麥長(zhǎng)管蚜抗性的關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)了與小麥長(zhǎng)管蚜抗性相關(guān)的標(biāo)記。賴運(yùn)平等[10]利用SSR標(biāo)記與小麥南大2419及其衍生品種主要農(nóng)藝性狀的關(guān)聯(lián)分析，得到與8個(gè)農(nóng)藝性狀顯著關(guān)聯(lián)的20個(gè)標(biāo)記。

本研究采用52個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)106個(gè)山東省及部分外省小麥育成品種（系）進(jìn)行遺傳多樣性分析，以了解近年育成小麥品種（系）之間的差異，為小麥育種工作提供參考；同時(shí)通過(guò)分子標(biāo)記與主要農(nóng)藝性狀的關(guān)聯(lián)分析，進(jìn)一步發(fā)掘與小麥產(chǎn)量、抗性等性狀相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 供試材料

106個(gè)供試小麥品種（系）包括37個(gè)山東省及部分外省近年育成品種、68個(gè)2015—2016年山東省小麥高肥區(qū)域試驗(yàn)品系及對(duì)照品種濟(jì)麥22（表1）。68個(gè)區(qū)試品系和對(duì)照濟(jì)麥22的產(chǎn)量性狀均為14個(gè)試點(diǎn)的平均值，數(shù)據(jù)來(lái)源于山東省區(qū)試調(diào)查結(jié)果。

1.2 基因組DNA提取

將供試各品種小麥種子排放在裝有濕潤(rùn)基質(zhì)的育苗穴盤(pán)內(nèi)，置于溫室內(nèi)培養(yǎng)，待幼苗長(zhǎng)至兩葉一心時(shí)，稱取幼苗葉片0.2 g，在液氮冷凍下快速研磨至粉末，用CTAB法提取基因組DNA[11]。加入RNaseA除去DNA樣品中的殘余RNA。使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA樣本的質(zhì)量。用超微量蛋白核酸分析儀測(cè)定DNA濃度，然后將DNA樣品稀釋到50 ng·μL-1，置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴(kuò)增和非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

選用分布在小麥不同染色體上的52個(gè)SSR標(biāo)記（表2）對(duì)DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)在T1型PCR擴(kuò)增儀（Biotech公司，德國(guó)）上進(jìn)行。PCR擴(kuò)增使用15 μL反應(yīng)體系，包括：10 × PCR buffer 1.5 μL，dNTPs 0.5 mmol，Mg2+ 1.6 mmol，Taq DNA 聚合酶 1 U，DNA 模板50～100 ng，上、下游引物各240 pmol，加ddH2O至15 μL。采用標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增程序，退火溫度針對(duì)不同引物單獨(dú)設(shè)定，35個(gè)循環(huán)，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染檢測(cè)，在白熾燈下進(jìn)行拍照和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

在相同遷移率位置上有擴(kuò)增條帶賦值為“1”，無(wú)條帶賦值為“0”，缺失賦值為“9”，統(tǒng)計(jì)每對(duì)標(biāo)記帶型，構(gòu)建矩陣。計(jì)算多態(tài)性信息含量（polymorphism information content，PIC），估測(cè)位點(diǎn)變異的表型效應(yīng)[12]，利用DPS軟件計(jì)算遺傳距離，然后導(dǎo)入MEGA 6.0程序進(jìn)行UPGMA聚類分析[13]。使用Structure 2.3.1軟件分析群體遺傳結(jié)構(gòu)，估計(jì)最佳的群體組群，K值范圍設(shè)定為1～10。使用TASSEL 3.0軟件的MLM模型進(jìn)行性狀和標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析，當(dāng)P<0.01時(shí)認(rèn)為標(biāo)記和性狀存在顯著關(guān)聯(lián)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記多態(tài)性

利用52個(gè)SSR標(biāo)記共得到150個(gè)等位位點(diǎn)，每個(gè)SSR標(biāo)記的等位位點(diǎn)數(shù)目為1～6個(gè)，平均為2.9個(gè)。每個(gè)SSR標(biāo)記的PIC值范圍為0.11～1.00，平均為0.51。其中PIC≥0.50的高度多態(tài)性標(biāo)記28個(gè)，0.25

2.2 聚類分析

根據(jù)52對(duì)引物的150條讀帶結(jié)果進(jìn)行聚類分析，可將106個(gè)品種（系）分為三個(gè)類群。

第一類群包括煙農(nóng)999、中植5號(hào)、周麥26號(hào)、紅地169、SNZN1693、ZH5013、博農(nóng)麥4號(hào)、徐麥1108共8個(gè)品種（系）。其中，煙農(nóng)999和徐麥1108（審定名稱為徐麥36）為山東省審定品種，中植5號(hào)、周麥26號(hào)、徐麥1108為外省品種。該類群與其他兩個(gè)類群在聚類分析中距離較遠(yuǎn)。

第二類群包括煙農(nóng)5158、泰農(nóng)18、AN01、山農(nóng)17、裕田麥119、岱麥3270、岱麥4493、山農(nóng)111、山農(nóng)15381、淄麥37、W-141、泰農(nóng)1014、齊麥2號(hào)、山農(nóng)25、CHA13-1、山農(nóng)23、YX14-2、山農(nóng)22、WH04-10、WH04-28、濱麥6號(hào)、泰麥6018、圣麥102、淄麥29、淄麥28、惟特3號(hào)、洲元9369、岱麥3640、LS018R、泰農(nóng)106、鑫秋811、鑫秋808、山農(nóng)29、XR-4429共34個(gè)品種（系）。其中煙農(nóng)5158、泰農(nóng)18、裕田麥119、泰農(nóng)1014、齊麥2號(hào)、山農(nóng)25、山農(nóng)23、山農(nóng)22、淄麥29、淄麥28、洲元9369、山農(nóng)29、XR-4429（審定名稱為鑫瑞29）為山東省審定品種。該類群以泰農(nóng)18為代表，淄麥29、淄麥28、LS018R、山農(nóng)29、岱麥號(hào)等均以泰農(nóng)18或其姊妹系為親本之一。

第三類群包括64個(gè)品種（系），數(shù)目最多，分別為：魯研128、魯原890、魯原502、YX14-1、博農(nóng)麥5號(hào)、濟(jì)麥47、紅地09-5、泰山6436、濟(jì)寧17、泰山28、鑫麥806、儒麥1號(hào)、濟(jì)麥262、臨麥4號(hào)、Am77、泰山24、泰山23、藁優(yōu)5218、藁優(yōu)5766、山農(nóng)0828、濟(jì)寧16、09F558-2、泰山27、郯麥98、景麥1號(hào)、邦麥3號(hào)、邦麥8號(hào)、煙農(nóng)24、濟(jì)麥229、濟(jì)麥19、登海51306、煙農(nóng)1212、鑫星169、煙農(nóng)836、煙529、XR3283、LS141R、濟(jì)麥40、濟(jì)麥39、煙農(nóng)173、煙農(nóng)197、濟(jì)麥44、DM007、冀冠509、良星99、良星66、FC0015、良星517、山農(nóng)20、清照15、良星77、煙農(nóng)157、泰山6038、鑫296、山農(nóng)27、登海51308、山農(nóng)32、山農(nóng)28、山農(nóng)31、菏麥0643-2、輪選151、DNK12-2、汶農(nóng)28、濟(jì)麥22。其中，魯原502、泰山6436（審定名稱為泰科麥33）、濟(jì)寧17、泰山28、儒麥1號(hào)、濟(jì)麥262、臨麥4號(hào)、泰山24、泰山23、濟(jì)寧16、泰山27、郯麥98、煙農(nóng)24、濟(jì)麥229、濟(jì)麥19、煙農(nóng)1212、煙農(nóng)836、煙農(nóng)173、良星99、良星66、良星517、山農(nóng)20、良星77、泰山6038（審定名稱為泰科麥31）、鑫296、山農(nóng)27、山農(nóng)32、山農(nóng)28、山農(nóng)31、濟(jì)麥22為山東省審定品種。該類群審定品種多、推廣面積大，許多審定品種與濟(jì)麥22和良星號(hào)具有密切的關(guān)系。

2.3 關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

經(jīng)關(guān)聯(lián)分析，52個(gè)SSR標(biāo)記中與重要農(nóng)藝性狀顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記共8個(gè)（表3）。其中，與千粒重顯著相關(guān)的分子標(biāo)記1個(gè)（wmc657），貢獻(xiàn)率為9.7%；與容重顯著相關(guān)的分子標(biāo)記4個(gè)（wmc322、gwm186、gwm292、wmc722），貢獻(xiàn)率為9.3%～11.9%；與生育期顯著相關(guān)的分子標(biāo)記1個(gè)（gwm67），貢獻(xiàn)率為9.5%；與株高顯著相關(guān)的分子標(biāo)記4個(gè)（cfd168、wmc322、gwm67、gpw294），貢獻(xiàn)率為9.8%～19.4%。gwm67與生育期和株高均顯著關(guān)聯(lián)，貢獻(xiàn)率分別為9.5%和10.8%；wmc322與容重和株高均顯著關(guān)聯(lián)，貢獻(xiàn)率分別為11.9%和18.0%。

3 討論與結(jié)論

遺傳多樣性分析是后續(xù)關(guān)聯(lián)分析的前提和基礎(chǔ)[14，15]。利用SSR標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性分析，確定各材料在不同標(biāo)記上的等位變異和基因型，可以在一定程度上反映材料之間的親緣關(guān)系。本研究利用52個(gè)SSR引物對(duì)山東省及部分省外近年審定品種和區(qū)試品系進(jìn)行遺傳多樣性分析，其平均PIC（0.51）小于潘玉鵬等[16]（0.55）和程西永等[6]（0.55）的研究結(jié)果；PIC變化范圍（0.11～1.00）大于潘玉鵬等[16]（0.25～0.89）和程西永等[6]（0.11～0.829）的研究結(jié)果。程西永等[6]的研究中所使用的引物與本研究存在部分重合（20對(duì)），通過(guò)計(jì)算相同引物的平均PIC值，發(fā)現(xiàn)本研究的結(jié)果（0.47）明顯低于程西永等[6]（0.58）的研究結(jié)果；蒲艷艷等[17]的研究中有7對(duì)引物與本研究相同，其相同引物的平均PIC值也高于本研究的。說(shuō)明近年山東省及部分省外育成品種（系）的遺傳多樣性總體呈下降趨勢(shì)。

聚類分析發(fā)現(xiàn)，山東省及部分省外近年育成品種（系）中，具有共同親本或同一育種單位育成的品種往往聚為一類，如源于同一育種單位的良星66、良星77、良星99、良星517都聚在第Ⅲ類；此外，部分山農(nóng)號(hào)（山農(nóng)0828、山農(nóng)20、山農(nóng)27、山農(nóng)28）、濟(jì)麥號(hào)（濟(jì)麥47、濟(jì)麥19、濟(jì)麥44）、泰山號(hào)（泰山28、泰山24、泰山23）、煙農(nóng)號(hào)（煙農(nóng)1212、煙農(nóng)173、煙農(nóng)197）品種也聚在此類群。親緣關(guān)系較近的泰農(nóng)18、山農(nóng)29、淄麥28、淄麥29、LS018R等都聚在第Ⅱ類。該結(jié)果在程西永[6]、程斌[18] 等的研究中均有體現(xiàn)。106份供試材料，以泰農(nóng)18為代表的第Ⅱ類群包含34個(gè)品種（系），以濟(jì)麥22和良星號(hào)為代表的第Ⅲ類群中包含64個(gè)品種（系），與兩者親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的第Ⅰ類群僅包含8個(gè)品種（系），且其中還有河南、江蘇等省外品種，這也反映了山東省近年育成品種（系）的遺傳基礎(chǔ)狹窄。因此，在今后的小麥育種中，應(yīng)在充分利用骨干親本的同時(shí)，積極引進(jìn)國(guó)內(nèi)外優(yōu)良種質(zhì)資源，創(chuàng)造新的種質(zhì)資源，不斷拓寬小麥育種的遺傳基礎(chǔ)。

近年，關(guān)聯(lián)分析在研究作物數(shù)量性狀方面得到了廣泛應(yīng)用。張國(guó)華等[19]利用64個(gè)SSR、27個(gè)EST-SSR、47個(gè)功能標(biāo)記分析其與黃淮麥區(qū)4個(gè)環(huán)境變量下的產(chǎn)量性狀的關(guān)聯(lián)性，發(fā)現(xiàn)有49個(gè)標(biāo)記與4個(gè)環(huán)境的產(chǎn)量性狀及其均值顯著關(guān)聯(lián)。朱玉磊等[20]利用181對(duì)SSR引物對(duì)其標(biāo)記位點(diǎn)與自然群體穗發(fā)芽抗性的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分析，共獲得20個(gè)顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。本研究檢測(cè)到8個(gè)與小麥重要農(nóng)藝性狀相關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記，其中，位于4B染色體上的wmc657標(biāo)記與千粒重顯著相關(guān)，這與張坤普等[21]將與千粒重相關(guān)的QTL定位在4B染色體wmc657-barc1096區(qū)段的研究結(jié)果一致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)對(duì)株高具有高貢獻(xiàn)率的標(biāo)記——cfd168和wmc322，對(duì)株高的貢獻(xiàn)率分別為19.4%和18.0%。

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