高志勇 謝恒星 李吉鋒 劉史力

摘要：轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種非常有效的分子生物技術(shù)，是一種利用TEs插入高等植物基因組中造成基因突變，然后通過(guò)分離TEs插入的旁鄰序列，克隆出突變基因的策略。這種策略在高等植物的功能基因組學(xué)研究中十分有用。玉米轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)主要有En/Spm系統(tǒng)、Ac/Ds系統(tǒng)和Mutator系統(tǒng)三大類。其中Mutator轉(zhuǎn)座子易于插入到基因內(nèi)部及基因周圍，引起的正向突變頻率為10-5～10-4，比野生玉米高出近30倍，所引起的突變大部分為隱性突變。由Mutator轉(zhuǎn)座子引起的突變，可以通過(guò)TAIL-PCR的方法，對(duì)相關(guān)的突變基因進(jìn)行克隆。當(dāng)前通過(guò)這種方法，已經(jīng)克隆出一些重要的基因。本文主要介紹了Mutator轉(zhuǎn)座子的應(yīng)用，并對(duì)Mutator轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的研究前景進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：玉米；Mutator轉(zhuǎn)座子；應(yīng)用；展望

中圖分類號(hào)：S513.035.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2018）05-0168-05

Abstract The transposon tagging is a very effective molecular biology technology developed in recent years. It causes gene mutation through TEs insertion into the genomes of higher plants， and then the mutanted genes can be cloned by isolating the flanking sequence of TEs. This strategy is very useful in the study of the functional genomics of higher plants. The main systems of maize transposon are En/Spm， Ac/Ds and Mutator ones. Among them， the Mutator transposon was prone to inserting within or around the gene； the positive mutation frequency was 10-5～10-4， which was nearly 30 times higher than that of the wild corn； and most of the mutations were recessive. The mutation can also be cloned by TAIL-PCR. Now by this method， some important genes have been cloned. In this paper， we mainly introduced the application of Mutator system， and discussed the research prospect of Mutator transposon system.

Keywords Maize； Mutator transposon； Application； Prospect

1951年，McClintock發(fā)現(xiàn)了玉米中的控制元件，后被命名為轉(zhuǎn)座元件或轉(zhuǎn)座子（transposon），在化學(xué)本質(zhì)上，轉(zhuǎn)座子是基因組中的一段DNA序列[1]。隨后，細(xì)菌、酵母、高等動(dòng)植物中的轉(zhuǎn)座元件也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)?；蚪M中的轉(zhuǎn)座子能從其原位點(diǎn)上復(fù)制或斷裂下來(lái)，通過(guò)環(huán)化，插入其他位點(diǎn)[2]。轉(zhuǎn)座子的發(fā)現(xiàn)大大推進(jìn)了分子生物學(xué)的發(fā)展。了解轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)，有助于解析生物遺傳進(jìn)化的具體機(jī)制，為生物學(xué)研究提供更加方便的工具。

玉米中的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)有三大類，即En/Spm系統(tǒng)[3]、Ac/Ds系統(tǒng)[4]和Mutator（Mu）系統(tǒng)[5]，其中誘變能力最高的是Mu轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)[6]。Mu轉(zhuǎn)座子可插入到基因的內(nèi)部及周圍，多引起隱性突變[7]。通過(guò)TAIL-PCR可以克隆出相應(yīng)的突變基因。1984年，采用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法，分離出了玉米的bronze基因，此后，通過(guò)這種方法，克隆出了更多基因?；蚪M內(nèi)的Mu轉(zhuǎn)座子，一般有較多的拷貝，所引起的突變常發(fā)生在非連鎖區(qū)域，引起表型突變。由于Mu轉(zhuǎn)座子的特有性質(zhì)和用途，使其成為目前分子生物學(xué)研究的一個(gè)重要焦點(diǎn)[8]。在反向遺傳學(xué)的研究中，Mu轉(zhuǎn)座子起到了重要的作用[9]。

在三大糧食作物（玉米、水稻、小麥）中，玉米年產(chǎn)量最高，現(xiàn)為世界第一大農(nóng)作物[10]。它不僅是重要的糧食和飼料作物，還是重要的食品工業(yè)原料和能源植物[11]。玉米的生產(chǎn)，在維護(hù)世界糧食安全和全球經(jīng)濟(jì)穩(wěn)定發(fā)展中，都占有重要的地位[12]。分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，推進(jìn)完成了玉米基因組序列測(cè)序，相應(yīng)地推進(jìn)了玉米功能基因組學(xué)研究，以及玉米種質(zhì)資源創(chuàng)制和分子育種研究。在基因功能的研究中，突變體是最直接有效的材料[13]，而在創(chuàng)制玉米突變體庫(kù)中，Mu轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)發(fā)揮著重要的作用。

1 Mu轉(zhuǎn)座子的分類及特征

1.1 Mu轉(zhuǎn)座子的分類

Mu轉(zhuǎn)座子家族包括兩個(gè)大類，即自主型的MuDR因子和非自主型因子。根據(jù)Mu插入片段內(nèi)部序列的特異性，可把Mu插入片段分為6個(gè)亞族，即Mu1/Mu2、Mu3、Mu4、Mu6/Mu7、Mu8、MuDR/Mu5[6]。這其中，把早先命名的MuA2、MuR1、Mu9和Cy統(tǒng)一劃歸為MuDR亞族，它們自身能編碼發(fā)生轉(zhuǎn)座所需要的蛋白質(zhì)；非自主型因子主要有Mu1/Mu2、Mu3、Mu4、Mu6/Mu7和Mu8，這一類因子不能自主轉(zhuǎn)座，只有在MuDR同時(shí)存在時(shí)，才能發(fā)生轉(zhuǎn)座。非自主型因子會(huì)因?yàn)樽灾餍鸵蜃拥拇嬖诙兊貌环€(wěn)定。后續(xù)的研究中，在2002年，Charles等又發(fā)現(xiàn)了3種Mu因子，包括Mu10、Mu11和Mu12[14]；2011年，Tan等在玉米的UniformMu家系中，發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)座因子Mu13[8]，這是一種具有活性的轉(zhuǎn)座因子。

1.2 Mu轉(zhuǎn)座子活性

Mu轉(zhuǎn)座子發(fā)生轉(zhuǎn)座的頻率很高[15]，可以發(fā)生在體細(xì)胞和生殖細(xì)胞。如果在體細(xì)胞中發(fā)生轉(zhuǎn)座子切除和插入，突變就可在當(dāng)代發(fā)生，容易發(fā)生回復(fù)突變，不可遺傳；而如果在前減數(shù)分裂細(xì)胞和配子中發(fā)生轉(zhuǎn)座，則回復(fù)突變的發(fā)生頻率就相對(duì)較低，通常能遺傳。因此，在評(píng)估Mu轉(zhuǎn)座子的活性時(shí)，一般要根據(jù)其家系與自交系的雜交后代進(jìn)行自交后，用所出現(xiàn)的突變數(shù)量進(jìn)行衡量。統(tǒng)計(jì)時(shí)，對(duì)質(zhì)量性狀突變，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)比較準(zhǔn)確；而對(duì)于數(shù)量性狀突變，環(huán)境因素的影響較大，使得統(tǒng)計(jì)結(jié)果可靠性較低[16]。

1.3 Mu插入位點(diǎn)特征

Mu雖然能在任何品系的基因組中引起插入突變，但不同的遺傳背景會(huì)影響Mu因子的轉(zhuǎn)座，并且在不同的基因中，突變頻率可相差8倍以上[17]。Mu轉(zhuǎn)座子插入在基因組中有著一定的偏好性，可插入到啟動(dòng)子、5′非轉(zhuǎn)錄區(qū)、外顯子和內(nèi)含子中。Mu轉(zhuǎn)座子插入的靶位點(diǎn)序列，是轉(zhuǎn)座酶識(shí)別并發(fā)生錯(cuò)切的特異序列[18]。通常情況下，Mu轉(zhuǎn)座子插入對(duì)近5′末端的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)有最強(qiáng)的偏好性[18]。

2 Mu轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽插入位點(diǎn)側(cè)翼序列的獲得方法

2.1 熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR

對(duì)已知序列的側(cè)翼序列進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，一般采用熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR（thermal asymmetric interlaced PCR， TAIL-PCR）方法。TAIL-PCR方法是一種染色體步移技術(shù)，首先運(yùn)用在分離黏粒（P1）載體和酵母人工染色體插入片段末端序列，后用于轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)側(cè)翼序列的測(cè)定。在TAIL-PCR中，利用嵌套的3個(gè)特異性引物，分別同簡(jiǎn)并引物組合，進(jìn)行連續(xù)的PCR循環(huán)，采取不同的退火溫度，選擇性地?cái)U(kuò)增出目標(biāo)片段，所得到的擴(kuò)增片段，可直接用作測(cè)序模板或探針標(biāo)記。試驗(yàn)過(guò)程中，首先根據(jù)DNA的已知序列，設(shè)計(jì)3條特異引物（special primer，SP），要求SP要同向且退火溫度較高，結(jié)合退火溫度較低的簡(jiǎn)并引物（可以設(shè)計(jì)多條，AP1、AP2、AP3……），進(jìn)行熱不對(duì)稱的PCR 反應(yīng)。一般情況下，簡(jiǎn)并引物至少要有一種，能利用退火溫度的差異，同特異性引物之間進(jìn)行熱不對(duì)稱的PCR 反應(yīng)。通常經(jīng)過(guò)3次巢式 PCR 反應(yīng)后，便可得到已知序列的側(cè)翼序列。在一次試驗(yàn)中所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度，如果滿足不了試驗(yàn)的要求，可以再依據(jù)第一次步移所獲得的序列信息，接著進(jìn)行側(cè)翼序列的擴(kuò)增[19]。

2.2 MuTAIL-PCR

根據(jù)Mu轉(zhuǎn)座子的TIR序列，Settles等[20]進(jìn)行了特異性巢式引物的設(shè)計(jì)，通過(guò)優(yōu)化TAIL-PCR，提出了MuTAIL-PCR的方法，可以對(duì)Mu因子插入靶位點(diǎn)側(cè)翼序列進(jìn)行專一性擴(kuò)增。MuTAIL-PCR方法簡(jiǎn)單，程序較少，應(yīng)用方便。其流程原理圖[21]如圖1。

劉文婷等[21]利用優(yōu)化的MuTAIL-PCR 技術(shù)，擴(kuò)增出105 條序列，經(jīng)生物信息學(xué)分析，其中的99 條為Mu轉(zhuǎn)座子的側(cè)翼序列，陽(yáng)性率達(dá)到94.2%，這個(gè)結(jié)果顯示，利用MuTAIL-PCR技術(shù)，可有效地?cái)U(kuò)增出Mu轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列。

3 Mu轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的應(yīng)用

Mu轉(zhuǎn)座子具有較高的正向突變率，傾向于插入基因富含區(qū)和低拷貝的序列區(qū)，因而從發(fā)現(xiàn)Mu轉(zhuǎn)座子開始，其在玉米功能基因組學(xué)的研究中，顯示出越來(lái)越廣泛的應(yīng)用[22]。

3.1 誘發(fā)基因突變

插入到功能基因附近或內(nèi)部的因子，都有可能改變基因的功能，引起可見表型的基因突變。在相對(duì)較少的群體內(nèi)，Mu轉(zhuǎn)座子可以誘發(fā)覆蓋全基因組的大量突變體。因?yàn)镸u轉(zhuǎn)座子具有比較保守的TIR，所以可以根據(jù)TIR 進(jìn)行PCR 引物的設(shè)計(jì)，對(duì)Mu轉(zhuǎn)座子誘發(fā)的插入突變?nèi)后w進(jìn)行高效的檢測(cè)[23]。Mu轉(zhuǎn)座子可插入到基因的任何區(qū)域，包括啟動(dòng)子、內(nèi)含子、外顯子等區(qū)域，引起基因的表達(dá)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，最終影響其功能[14]。由于Mu轉(zhuǎn)座子的這些特征，使得其有效地用于創(chuàng)建玉米突變體庫(kù)和進(jìn)行突變基因分離。

通過(guò)Mu轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)，已成功地創(chuàng)建了玉米突變體庫(kù)[24]。已使用過(guò)的構(gòu)建玉米突變體庫(kù)的方法中，有物理、化學(xué)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA和轉(zhuǎn)座子插入突變等多種方法[25]，從所得的試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看， Mu轉(zhuǎn)座子具有較高的誘變頻率、低插入位點(diǎn)偏愛(ài)性和基因組內(nèi)拷貝數(shù)多等特點(diǎn)。對(duì)所獲得的Mu轉(zhuǎn)座子誘導(dǎo)的突變體，要進(jìn)行Mu轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)側(cè)翼序列的生物信息學(xué)分析，方能預(yù)測(cè)突變基因功能。當(dāng)前，有多種分離Mu轉(zhuǎn)座子插入側(cè)翼序列的方法[26]，常用的有PCR步移技術(shù)、反向PCR技術(shù)[27]、TAIL-PCR技術(shù)、AFLP技術(shù)[28]等。

有研究者應(yīng)用Mu轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，成功地構(gòu)建了許多玉米突變體庫(kù)[29]。1995年，美國(guó)先鋒公司將Mu轉(zhuǎn)座子第一個(gè)應(yīng)用其中，成功地構(gòu)建了玉米性狀利用系統(tǒng)（trait utility system for corn， TUSC），并篩選出了幾百個(gè)由Mu轉(zhuǎn)座子插入引起的突變體。May等[30]公開征集了含Mu轉(zhuǎn)座子的40 000 個(gè)玉米家系，構(gòu)建了玉米定向誘變數(shù)據(jù)庫(kù)（maize targeted mutagenesis database， MTMdB）。Fernandes等[17]利用基因工程化的RescueMu，將其轉(zhuǎn)移到玉米品系中后，通過(guò)和Mu品系進(jìn)行雜交，使Mu因子發(fā)生轉(zhuǎn)座，得到了RescueMu序列數(shù)據(jù)庫(kù)。在含有Mu轉(zhuǎn)座子的W22 回交群體（UniformMu）中，McCarty等[31]通過(guò)DNA微陣列方法，篩選出了2 000 多個(gè)籽粒突變品系。國(guó)內(nèi)的研究中，引進(jìn)了具有活性Mu轉(zhuǎn)座子的材料作為供體，與本地優(yōu)良玉米自交系受體進(jìn)行雜交，獲得了大型插入誘變M1群體[21]。采用田間突變型鑒定、室內(nèi)籽粒性狀考察等方法，評(píng)價(jià)了Mu轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座頻率，并利用優(yōu)化的MuTAIL-PCR技術(shù)[20]擴(kuò)增、克隆、測(cè)序、生物信息學(xué)分析靶位點(diǎn)側(cè)翼序列，構(gòu)建了我國(guó)第一個(gè)玉米Mu轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的插入突變體庫(kù)。通過(guò)一個(gè)新的不依賴組織培養(yǎng)的玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米合子轉(zhuǎn)化方法，獲得了轉(zhuǎn)基因植株及后代。雌穗平均結(jié)實(shí)率為39%，合子轉(zhuǎn)化頻率達(dá)1%以上，并且轉(zhuǎn)化的基因可以遺傳[32]。

3.2 基因克隆及功能研究的標(biāo)簽

轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法是篩選由于基因內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)座子插入而導(dǎo)致突變表型的一種研究方法。利用分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)包含轉(zhuǎn)座子的突變基因進(jìn)行確定，再應(yīng)用突變基因的部分序列，進(jìn)行探針制備，用于分子雜交，把該基因的剩余片段從基因組文庫(kù)中篩選出來(lái)，對(duì)其進(jìn)行全序列測(cè)定。獲得的基因全序列，一方面要對(duì)序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以獲得基因的結(jié)構(gòu)和可能的理論生物學(xué)功能；另一方面對(duì)序列進(jìn)行載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化，鑒定出該基因的實(shí)際生物學(xué)功能。

通過(guò)Mu突變體庫(kù)已經(jīng)成功分離克隆了諸多基因[17]。在利用Mu突變體庫(kù)篩選甜玉米突變體的研究中，加速了甜玉米新種質(zhì)的創(chuàng)制，并推進(jìn)了對(duì)玉米胚乳發(fā)育與淀粉合成機(jī)制的認(rèn)識(shí)[33]。陳果等[34]利用Mu轉(zhuǎn)座子鑒定了5個(gè)響應(yīng)干旱脅迫的玉米蛋白磷酸酶基因；新近的研究，對(duì)玉米ZmCIPK23基因Mu插入突變體進(jìn)行了有效鑒定[35]。

4 Mu轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)研究展望

在Mu轉(zhuǎn)座子的研究中，發(fā)現(xiàn)自主性轉(zhuǎn)座因子MuDR有著重大的意義，圍繞MuDR 因子，今后還需要進(jìn)一步開展一系列的系統(tǒng)研究工作，涉及到Mu轉(zhuǎn)座子高頻轉(zhuǎn)座的機(jī)理，以及MuDR的表觀遺傳機(jī)理等。Mu轉(zhuǎn)座子可以進(jìn)行體細(xì)胞插入、共抑制，還具有較低的回復(fù)突變頻率，這些都增加了Mu轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)研究的復(fù)雜性，要有效地進(jìn)行這些研究工作，必須有創(chuàng)造性的思維。研究Mu因子同其寄主在進(jìn)化過(guò)程中的相互關(guān)系，也有著重大的意義。利用轉(zhuǎn)基因的方法，將Mu因子直接導(dǎo)入異源植物中，是一個(gè)困難重重但意義遠(yuǎn)大的課題，如果可以把活性Mu因子進(jìn)行轉(zhuǎn)化，那么Mu因子就可以作為有效的工具，應(yīng)用于其它異源物種的基因誘變，構(gòu)建異源物種的Mu轉(zhuǎn)座子插入突變體庫(kù)，開展基因分離等研究工作。對(duì)轉(zhuǎn)座活性抑制位點(diǎn)Muk促使MuDR產(chǎn)生沉默的機(jī)制，特別在基因轉(zhuǎn)錄水平上，需要進(jìn)行更深入的探討。所有這些研究成果，必將對(duì)分子生物學(xué)的發(fā)展起到巨大的促進(jìn)作用[36]。

當(dāng)前，擬南芥和水稻的基因組草圖已構(gòu)建成功，玉米基因組的測(cè)序也已完成[37]。面對(duì)這些大量的植物基因組序列信息，揭示各基因的具體功能意義重大[38]。要充分利用Mu因子的存在廣泛、拷貝數(shù)高等優(yōu)勢(shì)，使Mu因子標(biāo)簽法在分離克隆植物基因的研究中發(fā)揮出更加有效的作用。到目前為止，Mu轉(zhuǎn)座子是已發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)座活性最高、誘變能力最強(qiáng)的植物轉(zhuǎn)座因子，雖然對(duì)其轉(zhuǎn)座的調(diào)控機(jī)理還知道的較少，但在進(jìn)行玉米插入誘變、分離克隆基因中，Mu轉(zhuǎn)座子已成為重要的研究方法。伴隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展及對(duì)Mu轉(zhuǎn)座子特征和作用機(jī)理的深入研究，Mu因子系統(tǒng)必將在功能基因組學(xué)研究上展示出更大的作用。

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