張衛(wèi)東

（吉林省吉林市中心醫(yī)院病理科，吉林 吉林 132011）

非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin's lymphoma，NHL）為血 液淋巴系統(tǒng)腫瘤，其發(fā)病率在腫瘤疾病排名靠前。疾病的確證過程主要通過組織活檢完成。目前，B細(xì)胞淋巴瘤在我國不僅治愈率較低，重要的是病理診斷過程易與一些不明原因的淋巴結(jié)增生性疾病相混淆，應(yīng)該從遺傳學(xué)等免疫表型及分子水平進(jìn)行檢測方能做出確切診斷。同時，國外有相關(guān)研究表明，超過80%的B淋巴細(xì)胞瘤的染色體存在異常，其中常見的18q21的Bcl-2基因易位及擴(kuò)增較為常見[1-2]，且對B淋巴瘤的分型診斷及臨床預(yù)后具有重要的指導(dǎo)意義。但國內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)研究涉及較少。本研究則對54名曾入住本院的B淋巴瘤患者的石蠟組織切片進(jìn)行了熒光原位雜交（fluorescence in situ ybridization,FISH）分析及免疫組織化學(xué)分析，探討IgH基因序列重組作為新型生物診斷標(biāo)記物Bcl-2、Ki-67的可行性。

基因重排是以淋巴細(xì)胞單克隆增生為遺傳背景，為B細(xì)胞淋巴瘤提供診斷依據(jù)。胚系狀態(tài)下，B細(xì)胞淋巴瘤的免疫球蛋白基因由四個區(qū)域組成，分別為恒定區(qū)、鏈接區(qū)、可變區(qū)、多變區(qū)。各區(qū)域會有不同長度的基因序列插入，隨著細(xì)胞發(fā)育的逐步進(jìn)行，在特定酶的作用下，基因序列重新排列，構(gòu)成結(jié)構(gòu)基因，即為基因重排。B細(xì)胞淋巴瘤和增生性病變的B淋巴細(xì)胞的基因重排方式不同，從而導(dǎo)致淋巴瘤細(xì)胞的無限增殖特性[3]，因而會為臨床基因重排的診斷提供依據(jù)[4]。Kros等檢測的B細(xì)胞淋巴瘤IgH基因重排陽性率為77.0%，與王萍等[5]實(shí)驗檢測陽性率72.0%相近。Bcl-2蛋白作為凋亡抑制因子，對細(xì)胞凋亡有明顯抑制作用[6]，同時與患者預(yù)后有關(guān)。Bcl-2蛋白高表達(dá)主要見于濾泡性淋巴瘤[7]。

Ki-67在細(xì)胞周期中發(fā)揮作用，Ki-67基因高表達(dá)程度往往和B淋巴細(xì)胞的惡性增殖程度相關(guān)，同時也與B細(xì)胞淋巴瘤的惡性預(yù)后相關(guān)。由于Ki-67陽性率變異變化范圍較大，提示個體差異也比較明顯，Ki-67高表達(dá)與預(yù)后不良有關(guān)，檢測基因Ki-67現(xiàn)已被推廣應(yīng)用于腫瘤增殖活性的檢測當(dāng)中，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 本研究的54例NHL患者，均經(jīng)本院由2016年10月～2017年10月期間診治,確診均由醫(yī)院病理科經(jīng)過組織病理和免疫組織化學(xué)方法操作完成。其中彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）39例（占72%）、套細(xì)胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma）8例(占15%)，濾泡樣淋巴瘤（follicular lymphoma，F(xiàn)L）7例（占13%）。病理診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2008年WHO淋巴瘤分類標(biāo)準(zhǔn)。對照組共54例淋巴增生性病變患者的經(jīng)石蠟包埋的組織樣本。B細(xì)胞淋巴瘤患者與淋巴增生性病變患者兩組臨床資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。以上所有研究過程均通過患者同意并簽署知情同意書，包括同意相關(guān)實(shí)驗結(jié)果用于論文發(fā)表。也均經(jīng)本院臨床試驗委員會批準(zhǔn)通過。

1.2 試劑與方法 本研究方法通過免疫組織化學(xué)分析技術(shù)（IHC，Immunohistochemistry）識別分析B淋巴細(xì)胞的Bcl-2、Ki-67的表達(dá)情況。染色步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。首先經(jīng)過冰凍切邊，甲醇、丙酮固定，PBS充分清洗石蠟切片，然后滴入未標(biāo)記的鼠抗人一抗，放入37℃濕盒中孵育30 min，再用0.01 mol/L PBS清洗兩遍，每次時間為5 min，滴入帶有熒光標(biāo)記的二抗進(jìn)行染色，將標(biāo)本再次放入37℃濕盒中孵育30 min，重復(fù)進(jìn)行PBS清洗，最后利用甘油進(jìn)行封片，同時在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。IHC實(shí)驗后所有實(shí)驗結(jié)果均經(jīng)過兩名以上病理科醫(yī)師進(jìn)行復(fù)核。

隨機(jī)挑選一張染色切片20個高倍視野。以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒的細(xì)胞數(shù)大于25%時為Ki-67陽性標(biāo)記細(xì)胞、細(xì)胞數(shù)大于10%判定為Bcl-2陽性標(biāo)記的細(xì)胞作為結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)[8]。

熒光原位雜交技術(shù)（FISH）作為一種基因分析方法具有較高的靈敏度和分辨率。熒光原位雜交檢測IgH基因重組。熒光原位雜交技術(shù)通過有效安全的熒光標(biāo)記的分子探針與目的基因進(jìn)行原位雜交，顯示目的基因片段的DNA序列數(shù)量和相互的位置關(guān)系。此熒光原位雜交技術(shù)在細(xì)胞分子生物實(shí)驗技術(shù)領(lǐng)域具有極其重要的作用。

在此實(shí)驗研究中熒光原位雜交檢測探針包括兩部分，CEP8探針以綠色熒光Spectrum Green標(biāo)記；Bcl-2基因特異性位點(diǎn)探針以紅色熒光SpectrumRed標(biāo)記。3μm厚腫瘤組織切片事先固定后50℃培養(yǎng)箱中烤片3 h，甲酰胺變性3 min，再經(jīng)冰乙醇脫水步驟，將變性DNA探針滴于標(biāo)本上，37℃過夜，洗脫去除結(jié)合的非特在熒光顯微鏡下分別經(jīng)紅色、綠色和藍(lán)色濾光片捕獲不同熒光。每例隨機(jī)選擇60個大小接近、完整清晰、染色均勻、細(xì)胞核無重疊的區(qū)域進(jìn)行觀察。細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)3個或3個以上紅色信號判定為Bcl-2基因擴(kuò)增[9]。

本研究利用熒光原位雜交技術(shù)檢測研究B細(xì)胞淋巴瘤患者和淋巴組織增生患者的IgH基因重排情況，并聯(lián)合應(yīng)用組織化學(xué)等檢測方法檢測Bcl-2、Ki-67鑒別B細(xì)胞淋巴瘤和淋巴組織增生性病變，初步探討IgH基因重排聯(lián)合Bcl-2、Ki-67進(jìn)而鑒別淋巴組織增生性病變和B細(xì)胞淋巴瘤，對B細(xì)胞淋巴瘤的早期診斷、評價療效等方面具有重要的意義。也對淋巴瘤患者進(jìn)行準(zhǔn)確的診斷及指導(dǎo)治療，達(dá)到延長患者生存時間，提高患者生存率具有重要意義。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以x±s表示，兩組間比較采用雙向無序的R×C表資料的χ2檢驗。顯著性檢驗水準(zhǔn)為α=0.05；P＜0.05記為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Bcl-2基因檢測采用熒光原位雜交技術(shù)（FISH） 在熒光顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)下觀察，應(yīng)用FISH圖像分析軟件完成采集圖像、分析并完整保存。正常IgH基因經(jīng)過熒光原位雜交技術(shù)可見紅色和綠色相互融合的雜交信號，如果發(fā)生IgH基因重排，則其中綠色、紅色、黃色信號彼此分離并形成三個分離的信號，IgH基因重排顯示為≥3個黃色信號。將54例反應(yīng)性增生的淋巴結(jié)標(biāo)本按上述方法進(jìn)行熒光原位雜交實(shí)驗，每份樣本分析400個細(xì)胞，計算出異常信號的細(xì)胞數(shù)，本研究將IgH基因易位陽性閾值定義為10%，即分析100個腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)10個及10個以上黃色熒光的陽性細(xì)胞判斷為IgH基因重排。IgH基因重排在B細(xì)胞淋巴瘤患者中的重排率，見表1。

表1 IgH基因重排在B細(xì)胞淋巴瘤患者中的重排率Table 1 Rearrangement Rate of IgH Gene Rearrangement in Patients with B-Cell Lymphoma

2.2 Bcl-2、Ki-67蛋白表達(dá)情況采用免疫組織化學(xué)法 結(jié)果判定：蛋白主要位于細(xì)胞核呈棕褐色、棕黃色或淺黃色表達(dá)代表陽性結(jié)果。根據(jù)既往蛋白免疫組化標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀，以腫瘤組織中陽性細(xì)胞進(jìn)行百分率計數(shù)。同時，按照Hans等分類標(biāo)準(zhǔn)，以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒物質(zhì)的細(xì)胞數(shù)＞25%時為Ki-67陽性標(biāo)記細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)＞10%判定為Bcl-2陽性標(biāo)記的細(xì)胞作為結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)。在B細(xì)胞淋巴瘤患者中Bcl-2、Ki-67蛋白表達(dá)情況見表2。

表2 在B細(xì)胞淋巴瘤患者中Bcl-2、Ki-67蛋白表達(dá)情況Table 2 Expression of Bcl-2 and Ki-67 Protein in Patients with B-Cell Lymphoma

實(shí)踐證明多種抗體聯(lián)合檢測的方法，對提高B細(xì)胞淋巴瘤診斷正確率具有重要作用。聯(lián)合檢測對淋巴瘤與淋巴細(xì)胞增生性病變的鑒別診斷及預(yù)后判斷較單一抗體檢測更為可靠。在B細(xì)胞淋巴瘤患者中IgH基因重排、Bcl-2、Ki-67蛋白表達(dá)情況見表3。在分子水平尋找分子靶位，對腫瘤的個體化和預(yù)見性治療具有指導(dǎo)意義。目前本院應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)檢測IgH基因還處于原始階段，我們將此結(jié)論應(yīng)用于臨床，幫助患者鑒別淋巴瘤與淋巴結(jié)增生性疾病，提高患者生存治療。為鑒別淋巴瘤與淋巴結(jié)增生性疾病的診斷提供可靠的科學(xué)依據(jù)。

表3 在B細(xì)胞淋巴瘤患者中IgH基因重排、Bcl-2、Ki-67蛋白表達(dá)情況Table 3 Expression of IgH gene rearrangement,Bcl-2,Ki-67 protein in patients with B-cell lymphoma

3 討論

基于血漿的B細(xì)胞淋巴瘤診斷方法，可能為腫瘤治療的療效評價提供了一種新途徑。在循環(huán)血中能找到各種實(shí)體腫瘤突變的DNA，初步分析證實(shí)了這些重組基因序列的存在，在很多情況下，這些檢測應(yīng)用于臨床非常有價值。

本研究未從血漿檢測中發(fā)現(xiàn)重組基因的患者，其原因可能是經(jīng)過治療后病情達(dá)到完全緩解?？傊?，對已經(jīng)接受治療的B細(xì)胞淋巴瘤患者進(jìn)行IgH基因檢測是一種個性化的先進(jìn)的監(jiān)測方法[9]，通過檢測患者重組IgH基因重排情況進(jìn)行診斷和評價，這不僅是在科學(xué)研究領(lǐng)域上的一大突破，也為臨床監(jiān)測NHL患者病情提供了可能。

B細(xì)胞淋巴瘤患者的Bcl-2和Ki-67基因易位與B細(xì)胞淋巴患者Bcl-2和Ki-67蛋白表達(dá)關(guān)系密切。因此，對于Bcl-2和Ki-67蛋白表達(dá)陽性的患者，發(fā)生Bcl-2和Ki-67基因易位的可能性較二者均陰性患者發(fā)生幾率大，經(jīng)本研究發(fā)現(xiàn)，建議利用FISH檢測方法，需在常規(guī)檢測前提下進(jìn)一步指導(dǎo)B細(xì)胞淋巴患者臨床治療。Bcl-2和Ki-67基因擴(kuò)增也是B細(xì)胞淋巴瘤患者腫瘤細(xì)胞內(nèi)基因異常的重要方式，但目前對其作用機(jī)制尚無明確結(jié)論，還需要進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，IGH基因重排聯(lián)合Bcl-2、Ki-67對B細(xì)胞淋巴瘤和增生性病變有重要的鑒別意義。