◎ 楊延存，蔡甜甜，于海坤，侯笑林

（青島工學(xué)院，山東 青島 266300）

黑蒜是利用新鮮生蒜，帶皮在發(fā)酵箱里發(fā)酵60～90 d后制成的食品，黑蒜以超高營養(yǎng)價(jià)值以及“甜、軟、糯”的口感正逐漸被人們認(rèn)識(shí)和認(rèn)可，并走向百姓生活[1]。黑蒜食后無蒜臭，與普通大蒜所不同。各類文獻(xiàn)顯示，各種多糖在增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗炎癥、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗輻射、抗菌抗病毒和保護(hù)肝臟等多方面的生物活性已相繼被發(fā)現(xiàn)，它的作用幾乎涉及機(jī)體免疫系統(tǒng)的各個(gè)方面[2-4]。作為多糖的一種，黑蒜多糖的提取方法仍在不斷地改進(jìn)[5]，本研究擬采用木瓜蛋白酶輔助水提醇沉法提取黑蒜粗多糖，建立一種簡便易行、適合常規(guī)實(shí)驗(yàn)室、具有一定穩(wěn)定性的黑蒜多糖含量提取方法，為進(jìn)一步研究黑蒜多糖提供科學(xué)根據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

黑蒜（網(wǎng)上采購，新鮮、無公害、無糜爛）。

1.2 儀器與設(shè)備

750T型多功能粉碎機(jī)（鉑歐五金廠），KH5200B型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）、80-2電動(dòng)離心機(jī)（上海梅香儀器有限公司），722N型分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司），101-3A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52A（上海亞榮生化儀器廠）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 提取流程[6]

黑蒜→粉碎→脫脂→加入蒸餾水及酶→一定條件超聲→滅酶→離心取上清液→蒸發(fā)濃縮→除蛋白質(zhì)→醇沉取沉淀→洗滌→醇沉取沉淀→干燥→溶解→測吸光度。

1.3.2 黑蒜中多糖含量的測定及計(jì)算方法[7]

精確稱取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖100 mg于500 mL容量瓶中，加蒸餾水定容。分別量取0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL和1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL試管中，加蒸餾水2.0 mL并搖勻。分別加入新配制的苯酚試劑1.2 mL、濃硫酸5 mL，搖勻，放置5 min，沸水浴中加熱15 min。取出后冷卻至室溫。以蒸餾水2 mL加苯酚和硫酸，同上做空白對照。于490 nm波長處測定吸光度，以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程。

稱取干燥后的黑蒜粗多糖，加入200 mL容量瓶中，蒸餾水定容。量取0.5 mL，按上述方法測吸光度，代入方程，求多糖含量。

式中：C為在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出的糖含量，mg/mL；V總為提取液總體積，mL；V測為測定時(shí)取用體積，mL；W為樣品重量，mg；D為稀釋倍數(shù)。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

（1）酶用量對黑蒜多糖提取率的影響。準(zhǔn)確稱取5.0 g脫脂黑蒜粉，按1∶30（g/mL）料液比加入蒸餾水，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%的木瓜蛋白酶，在pH 5.0、提取溫度50 ℃條件下超聲提取60 min，按工藝流程進(jìn)行多糖提取。以多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)定，確定最佳酶用量。平行兩次試驗(yàn)，下同。

（2）酶作用pH對黑蒜多糖提取率的影響。準(zhǔn)確稱取5.0 g脫脂黑蒜粉，按1∶30（g/mL）料液比加入蒸餾水，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的木瓜蛋白酶，調(diào)節(jié)溶液pH分別為5.0、5.5、6.0、6.5和7.0，在提取溫度為50 ℃條件下超聲提取60 min，按工藝流程進(jìn)行多糖提取。以多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)定，確定最佳酶作用pH。

（3）提取溫度對黑蒜多糖提取率的影響。準(zhǔn)確稱取5.0 g脫脂黑蒜粉，按1∶30（g/mL）料液比加入蒸餾水，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的木瓜蛋白酶，調(diào)節(jié)溶液pH為5.0，分別在提取溫度為45、50、55、60 ℃和65 ℃條件下超聲提取60 min，按工藝流程進(jìn)行多糖提取。以多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)定，確定最佳提取溫度。

（4）超聲時(shí)間對黑蒜多糖提取率的影響。準(zhǔn)確稱取5.0 g脫脂黑蒜粉，按1∶30（g/mL）料液比加入蒸餾水，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的木瓜蛋白酶，調(diào)節(jié)溶液pH為5.0，在提取溫度為50 ℃條件下分別超聲20、40、60、80 min和100 min，按工藝流程進(jìn)行多糖提取。以多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)定，確定最佳超聲時(shí)間。

1.3.4 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選酶用量、酶作用pH、提取溫度、超聲時(shí)間四因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，每個(gè)因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平，以多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，優(yōu)化黑蒜多糖提取工藝條件。

1.3.5 黑蒜多糖抗氧化活性的測定

（1）DPPH清除作用的測定[8,9]。以維生素C為陽性對照。在試管中按順序加入2.5 mL 6×10-5mol/L DPPH溶液，一定體積的黑蒜多糖提取液、維生素C，用蒸餾水補(bǔ)足到4 mL，對照管用蒸餾水代替，各管混勻，避光20 min，于517 nm處測定吸光度值，計(jì)算清除率。

式中，A1為4 mL樣液+2 mL DPPH對應(yīng)吸光度值；A2為4 mL樣液+2 mL 95%的乙醇對應(yīng)吸光度值；A3為4 mL蒸餾水+2 mL DPPH對應(yīng)吸光度值。

（2）羥自由基（?OH）清除作用的測定[10]。以維生素C為陽性對照。取0.2 mL 10 mmol/L FeSO4-EDTA混合液，0.2 mL 10 mmol/L 2-脫氧核糖溶液，1.0 mL待測液，0.4 mL PBS液，0.2 mL 10 mmol/L過氧化氫溶液，置于37 ℃恒溫水浴中1 h，在532 nm處測定其吸光度As。用1.0 mL蒸餾水代替待測液作對照，測得吸光度為A0，計(jì)算清除率SA。

（3）黑蒜多糖對大豆油抗氧化能力的測定[6]。將加入黑蒜多糖的菜籽油試樣按照質(zhì)量百分比0.5%攪拌均勻，然后置于60 ℃的烘箱自氧化，每24 h取樣測定菜籽油的過氧化值（POV）。按GB/T 5538-2005測定油脂的過氧化值，過氧化值以每千克中活性氧的毫克當(dāng)量表示。

式中，V1為試樣消耗Na2S2O3體積，mL；V2為空白消耗Na2S2O3體積，mL；C為Na2S2O3濃度，mol/L；m為試樣質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶用量對黑蒜多糖提取率的影響

由圖1知，隨著酶用量的增加，黑蒜多糖的提取率增加，當(dāng)酶用量達(dá)到1.5%時(shí)，黑蒜多糖提取率達(dá)到最大值；隨著酶用量繼續(xù)增加，多糖提取率呈現(xiàn)下降趨勢。這可能是因?yàn)槊柑砑恿可儆?.5%時(shí)，反應(yīng)中底物濃度過量，反應(yīng)速度取決于酶濃度，在此時(shí)，底物的有效轉(zhuǎn)化隨著酶濃度的增加而呈直線的增加，多糖的提取率隨之升高；酶濃度在1.5%～2.5%時(shí)，酶添加量相對于底物濃度過量，底物在酶的作用下就會(huì)首先分解掉一部分非目標(biāo)產(chǎn)物，進(jìn)而分解掉從底物中溶出的黑蒜多糖。所以對于黑蒜多糖的提取率來說存在一個(gè)最佳的酶濃度，為了縮短工時(shí)、節(jié)約資源，選酶用量1.5%為宜。

圖1 酶用量對黑蒜多糖提取率的影響圖

2.2 酶作用pH對黑蒜多糖提取率的影響

由圖2可以看出，隨著pH的增加，黑蒜多糖提取率逐漸增加，當(dāng)pH為6.0時(shí)，黑蒜多糖提取率達(dá)到最高；隨著pH的繼續(xù)增加，黑蒜多糖提取率反而呈下降趨勢。原因可能是酶對pH非常敏感，每一種酶都是在一定pH范圍內(nèi)發(fā)揮作用，如果環(huán)境中的pH超出這個(gè)范圍，酶的活性就會(huì)降低甚至失去活性，只有在一定pH范圍時(shí)，其活性才會(huì)達(dá)到最高，該值即是酶的最適pH，偏離此值，無論pH是增加還是減小，酶的活性都會(huì)降低，進(jìn)而導(dǎo)致黑蒜多糖提取率的降低。因此，黑蒜多糖提取的最適pH為6.0。

圖2 酶作用pH對黑蒜多糖提取率的影響圖

2.3 提取溫度對黑蒜多糖提取率的影響

從圖3可以看出，隨著酶解溫度的升高，黑蒜多糖的提取率增加，當(dāng)溫度達(dá)到55 ℃時(shí)，黑蒜多糖的提取率達(dá)到最大；當(dāng)酶解溫度繼續(xù)升高時(shí)，提取率下降。這可能是因?yàn)闇囟炔粌H影響多糖的溶出速度，而且影響木瓜蛋白酶的活性，隨著溫度的升高，木瓜蛋白酶的酶解活性增加，進(jìn)而使得黑蒜多糖提取率升高。但當(dāng)溫度超過55 ℃時(shí)，過高的溫度影響了酶的活性，導(dǎo)致木瓜蛋白酶活性降低甚至喪失，從而影響黑蒜多糖的提取率，因此最佳提取溫度為55 ℃。

圖3 提取溫度對黑蒜多糖提取率的影響圖

2.4 超聲時(shí)間對黑蒜多糖提取率的影響

由圖4可以得知，黑蒜多糖提取率隨著超聲時(shí)間的延長而逐漸升高，提取率在20～80 min內(nèi)增加明顯，且在80 min時(shí)達(dá)到最大，之后，隨著超聲時(shí)間的增加，提取率開始下降。這可能是由于某些糖苷鍵因提取時(shí)間過久在蛋白酶的催化作用下被分解，或是提取時(shí)間過長引起多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，甚至使碳環(huán)裂解導(dǎo)致。因此，為減少提取過程中黑蒜多糖的損失，選取80 min為最佳超聲時(shí)間。

圖4 超聲時(shí)間對黑蒜多糖提取率的影響圖

2.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化

由表1可知，試驗(yàn)中四個(gè)因素的影響力大小順序?yàn)镃＞A＞B＞D，對應(yīng)影響黑蒜多糖提取率效果因素的強(qiáng)弱順序?yàn)樘崛囟龋久赣昧浚久缸饔胮H＞超聲時(shí)間，且黑蒜中多糖的最佳提取工藝為A2B3C2D1。由于計(jì)算出的最優(yōu)組合不包含在正交表中，因而按最優(yōu)組合配方進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得出黑蒜多糖的最佳提取率為10.15%，高于A2B1C2D3，因此確定A2B3C2D1為提取黑蒜多糖的最佳工藝條件，即酶用量為1.5%、酶作用pH為6.5、提取溫度為55 ℃、超聲時(shí)間為75 min。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果表

2.6 黑蒜多糖與維生素C對DPPH清除率的效果差異

由圖5可知，維生素C與黑蒜多糖對DPPH均有較強(qiáng)的清除作用。維生素C在濃度0.05～0.25 mg/mL的范圍內(nèi)對DPPH的清除率基本保持緩慢升高的變化趨勢，而黑蒜多糖則表現(xiàn)出隨濃度的升高，清除率快速增長的趨勢，清除能力逐漸增強(qiáng)，即抗氧化性也是逐漸增強(qiáng)，但與相同濃度條件下的維生素C相比，其對DPPH自由基的清除率明顯要低，可見黑蒜多糖的抗氧化能力弱于維生素C。

圖5 黑蒜多糖與維生素C對DPPH清除率的效果差異圖

2.7 黑蒜多糖與維生素C對?OH清除率的效果差異

由圖6可知，維生素C與黑蒜多糖對?OH均有較強(qiáng)的清除作用，都隨濃度的增大而升高，在濃度為0.2～0.6 mg/mL范圍內(nèi)清除率快速增長，在0.6～1.0 mg/mL范圍內(nèi)增長緩慢。但黑蒜多糖與相同濃度條件下的維生素C相比，其對?OH的清除率明顯要低，清除效果弱于維生素C。

圖6 黑蒜多糖與維生素C對?OH清除率的效果差異圖

2.8 黑蒜多糖與維生素C對大豆油抗氧化能力的效果差異

從圖7可以看出，隨著放置時(shí)間的延長，大豆油的POV值呈上升趨勢，即大豆油易被氧化。加入了黑蒜多糖和維生素C的樣品較空白上升的緩慢，同時(shí)加入相同濃度黑蒜多糖的樣品較加入維生素C的樣品POV值要小，表明黑蒜多糖可以較維生素C更有效的抑制大豆油的氧化，黑蒜多糖對大豆油的抗氧化能力強(qiáng)于維生素C。

圖7 黑蒜多糖與維生素C對大豆油的抗氧化的效果差異圖

3 結(jié)論

木瓜蛋白酶輔助水提醇沉法提取黑蒜多糖的最佳提取條件為酶用量為1.5%、酶作用pH為6.5、提取溫度為55℃、超聲時(shí)間為75 min，由此工藝條件下提取的黑蒜多糖提取率可達(dá)10.15%。

黑蒜多糖對DPPH和?OH均表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除能力，在一定濃度范圍內(nèi)，清除率隨濃度的增大而升高，但與維生素C相比，黑蒜多糖的清除效果要差，而黑蒜多糖對大豆油的抗氧化能力較維生素C強(qiáng)，能夠有效抑制大豆油的氧化。