◎ 甄鵬晨，高育哲

（沈陽(yáng)師范大學(xué)糧食學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110034）

咖啡豆，普遍是指用于制作咖啡的植物果實(shí)，早期的食用方式是阿拉伯人發(fā)明的，他們將整顆果實(shí)（coffee cherry）咀嚼以吸取其汁液。后來(lái)他們將磨碎的咖啡豆與動(dòng)物的脂肪混合，以此作為長(zhǎng)途旅行的體力補(bǔ)充劑，一直到約公元1000年，咖啡豆才被拿來(lái)在滾水中煮沸成為芳香的飲料。近年來(lái)，人均體重逐漸增加，咖啡作為一種減肥飲品已成為大眾的心頭喜，并衍生了我國(guó)所特有的咖啡文化，而咖啡豆也廣泛應(yīng)用于我國(guó)的食品工業(yè)中。此外，咖啡豆并非只能作為人類的食物，有研究表明，咖啡豆中所含的球蛋白具有獨(dú)特的理化性質(zhì)和很好的驅(qū)蟲(chóng)效果，但關(guān)于提取咖啡豆蛋白質(zhì)的最優(yōu)工藝條件及其性質(zhì)的研究，目前國(guó)內(nèi)少有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以正交實(shí)驗(yàn)法探究堿溶酸沉法提取咖啡豆蛋白質(zhì)的最佳條件，并對(duì)提取的咖啡豆蛋白質(zhì)性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。本研究可以有效減少咖啡豆的物料消耗，實(shí)現(xiàn)廢物減量化、資源化，符合當(dāng)前所倡導(dǎo)的綠色工業(yè)理論，同時(shí)對(duì)咖啡副產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)具有一定的研究意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

以同一批次的多袋云南景慶生咖啡豆為原料，經(jīng)徹底粉碎研磨后過(guò)100目篩，放在烘箱中以40 ℃低溫烘干至恒重之后，待稱量備用。

1.1.2 試劑

氫氧化鈉、石油醚、鹽酸、硫酸、硫酸鉀、硼酸、亞甲基藍(lán)、甲基紅和蒸餾水等，除蒸餾水為實(shí)驗(yàn)室自制外，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Hettich臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)Mikro-220R（德國(guó)Hettich公司）、SKD-200凱氏定氮儀（上海沛歐分析儀器有限公司）、高速分散機(jī)（ULTRA-TURRAX T 25 basic IKA-WERKE）、氨基酸分析儀（塞卡姆S433D氨基酸分析儀）、HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司）、精宏電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、電子天平（沈陽(yáng)龍燚電子科技公司）、ESJ120-4B型分析天平（沈陽(yáng)龍騰電子有限公司）、BCD-205小天鵝冰箱（江蘇小天鵝電器有限責(zé)任公司）、UV5100型紫外分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）。

1.3 提取流程

本研究采取堿溶酸沉的傳統(tǒng)方法提取咖啡豆蛋白，經(jīng)凍干后對(duì)得出的蛋白質(zhì)粉末進(jìn)行蛋白質(zhì)提取率的測(cè)定，確定最優(yōu)的提取工藝條件。咖啡豆蛋白質(zhì)的提取工藝流程如下：生咖啡豆→研磨粉碎→過(guò)篩→石油醚脫脂→堿液溶解→離心取上清液→加酸至等電點(diǎn)→離心取沉淀→凍干→咖啡豆蛋白質(zhì)。

1.4 單因素實(shí)驗(yàn)

在正交實(shí)驗(yàn)之前，首先進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，確定該因素是否會(huì)對(duì)咖啡豆蛋白質(zhì)的提取產(chǎn)生影響以及影響的幅度。在本研究中，在控制其他變量不變的情況下，分別對(duì)咖啡豆蛋白質(zhì)堿溶酸沉中所采用的提取溫度（35、40、45、50、55 ℃和60 ℃）、提取時(shí)間（30、45、60、75、90 min 和 105 min)以及 pH（8、9、10、11、12和13）這3項(xiàng)因素進(jìn)行控制，在不同條件下進(jìn)行堿溶酸沉法提取咖啡豆蛋白質(zhì)。提取后采用凍干法制得蛋白質(zhì)粉末，稱量確定在該條件下咖啡豆蛋白質(zhì)的提取量，并比較不同結(jié)果。

1.5 正交實(shí)驗(yàn)

以咖啡豆蛋白質(zhì)提取率為指標(biāo)，對(duì)提取溫度、提取時(shí)間、堿溶時(shí)的pH為影響因素，進(jìn)行三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平見(jiàn)表1。

表1 咖啡豆蛋白質(zhì)提取工藝正交因素表

1.6 氨基酸組成的測(cè)定

稱取少量咖啡豆粉末，將其送入氨基酸分析儀中，依照GB 5009.124-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測(cè)定》中所示方法測(cè)定咖啡豆粉末中不同的氨基酸。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 提取溫度的確定

在控制其他變量（提取時(shí)間60 min、酸堿度pH 11）不變的情況下，在不同提取溫度的條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同提取溫度條件下咖啡豆蛋白質(zhì)的提取率圖

由圖1可知，提取溫度因素對(duì)咖啡豆蛋白質(zhì)提取率的影響較為平緩，隨著提取溫度的逐漸上升咖啡豆蛋白質(zhì)的提取率也在逐漸上升。當(dāng)溫度處于45～50 ℃時(shí)，咖啡豆蛋白質(zhì)的提取率有較大提高，推測(cè)可能在45～50 ℃處于較優(yōu)的提取工藝條件，因而提高率較高。

2.1.2 提取時(shí)間的確定

在控制其他變量（提取溫度60 ℃、酸堿度pH 11）不變的情況下，在不同提取時(shí)間的條件下進(jìn)行試驗(yàn)，所得結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，提取時(shí)間因素對(duì)咖啡豆蛋白質(zhì)提取率的影響較高，隨著提取所用的時(shí)間逐漸增長(zhǎng)，咖啡豆蛋白質(zhì)的提取率由15.07%逐漸上升到了最高的38.47%，最后趨于平緩甚至逐漸下降的趨勢(shì)。推測(cè)產(chǎn)生這種趨勢(shì)的原因是單因素實(shí)驗(yàn)中所使用的溫度較高，長(zhǎng)時(shí)間水浴提取可能會(huì)導(dǎo)致某些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變從而變性。

2.1.3 pH值的確定

在控制其他變量（提取溫度50 ℃、提取時(shí)間60 min）不變的情況下，在不同pH的條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同pH下咖啡豆蛋白質(zhì)的提取率圖

由圖3可知，酸堿度對(duì)咖啡豆蛋白質(zhì)的提取影響較高，這種現(xiàn)象在pH＜9或pH＞12時(shí)尤為明顯，而在pH 9～11影響較小，且在pH 9～11時(shí)咖啡豆蛋白質(zhì)的提取率要明顯高于不同的pH值時(shí)咖啡豆蛋白質(zhì)的提取率。推測(cè)產(chǎn)生這種趨勢(shì)的原因是因?yàn)楫?dāng)pH過(guò)低時(shí)，提取液的酸堿度與水幾乎無(wú)異，無(wú)法很好地溶解咖啡豆粉末中的蛋白質(zhì)，從而導(dǎo)致咖啡豆蛋白質(zhì)的提取率偏低；而當(dāng)pH較高時(shí)，溶液中過(guò)量的堿離子會(huì)導(dǎo)致咖啡豆蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變從而變性，導(dǎo)致提取出來(lái)的蛋白質(zhì)量減少。同時(shí)，該單因素實(shí)驗(yàn)的蛋白質(zhì)提取率顯著小于其他單因素實(shí)驗(yàn)，初步考慮是因?yàn)槠渌兞坎贿m而導(dǎo)致的。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

使用正交實(shí)驗(yàn)法探究提取溫度、提取時(shí)間、溶液酸堿度3種因素對(duì)咖啡豆蛋白質(zhì)的提取率的影響。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)處理表

通過(guò)表2所列數(shù)據(jù)的計(jì)算，可以計(jì)算由于因素A（溫度）的變化所引起的蛋白質(zhì)提取率的變化。由于在項(xiàng)KA1、KA2、KA3中，因素BC的各水平均只出現(xiàn)了1次，且因B、C間無(wú)交互作用，所以B、C兩因素的不同組合理論上對(duì)各實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不存在影響。因此，對(duì)于該研究來(lái)說(shuō)，三組實(shí)驗(yàn)的條件是完全相同的。若因素A對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)影響，則KA1、KA2、KA3三項(xiàng)數(shù)值應(yīng)相等。但通過(guò)對(duì)比，我們可以發(fā)現(xiàn)在因素A的三個(gè)水平中，KA1、KA2、KA3三項(xiàng)數(shù)值明顯并不相等，且KA1

同理，可以對(duì)因素B、C進(jìn)行以上計(jì)算，得出的結(jié)果如表2所示。由結(jié)果可得結(jié)論：在堿溶酸沉法對(duì)咖啡豆蛋白質(zhì)進(jìn)行提取的過(guò)程中，因素B（進(jìn)行提取的時(shí)間）和因素C（提取時(shí)的酸堿度）對(duì)咖啡豆蛋白質(zhì)的提取率均具有影響。其中因素B的影響較為顯著，在本實(shí)驗(yàn)研究范圍內(nèi)的最適時(shí)長(zhǎng)是90 min；而因素C的影響較為微小，在本實(shí)驗(yàn)研究范圍內(nèi)的最適酸堿度為pH 10。

由表中R（極差值）可知，提取溫度、提取時(shí)間、酸堿度3種因素對(duì)咖啡豆蛋白質(zhì)提取率影響大小依次為提取時(shí)間＞提取溫度＞酸堿度，其中時(shí)間是影響咖啡豆蛋白質(zhì)提取率的主要因素。

2.3 咖啡豆蛋白質(zhì)的氨基酸組成

實(shí)驗(yàn)取咖啡豆原料粉末0.115 g，測(cè)定其氨基酸的組成及含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 咖啡豆原料粉中各項(xiàng)氨基酸組成表

由表3可以看出，咖啡豆粉末中氨基酸的含量非常豐富，都含有谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、精氨酸等共16種氨基酸。其中對(duì)于成年人來(lái)說(shuō)的8種必需氨基酸包含6種，相對(duì)較為齊全，配比也較為合理。必需氨基酸與條件必須氨基酸的總含量合計(jì)占了總質(zhì)量的7.50%、占了蛋白質(zhì)總質(zhì)量的67.02%，尤其其中賴氨酸的含量處于中等偏上的比例，可以一定程度上彌補(bǔ)我國(guó)傳統(tǒng)膳食結(jié)構(gòu)中的賴氨酸的不足，減少“賴氨酸缺乏癥”的產(chǎn)生。盡管咖啡豆粉末或者咖啡制品不易大量攝入，但咖啡蛋白質(zhì)獨(dú)特的組成和性質(zhì)未來(lái)在工業(yè)上也許會(huì)另有用途。

3 結(jié)論

在堿溶酸沉法提取咖啡豆蛋白質(zhì)的工藝過(guò)程中，對(duì)蛋白質(zhì)提取率造成較大影響的因素是進(jìn)行堿溶提取工藝的時(shí)間，對(duì)蛋白質(zhì)提取率影響較小的因素為進(jìn)行提取時(shí)的酸堿度（在適宜范圍內(nèi)）。而在本實(shí)驗(yàn)的研究范圍中，最佳工藝條件為溫度55 ℃、提取時(shí)間90 min、堿溶的pH 10。

咖啡豆蛋白質(zhì)中氨基酸種類較為豐富，人體必需氨基酸比例較高，占咖啡粉總質(zhì)量的7.50%、咖啡豆蛋白質(zhì)總質(zhì)量的67.02%。