◎ 阮金如

（紅河州食品藥品檢驗(yàn)所，云南 紅河 661100）

發(fā)酵乳是以生牛（羊）乳或乳粉為原料，經(jīng)殺菌、發(fā)酵后制成的pH降低的產(chǎn)品。乳酸是以生牛（羊）乳或乳粉為原料，經(jīng)殺菌、接種嗜熱鏈球菌和保加利亞桿菌（德氏乳桿菌保加利亞亞種）發(fā)酵制成的產(chǎn)品，按GB 19302-2010《發(fā)酵乳》執(zhí)行[2]。在日常生活中，最常見(jiàn)的發(fā)酵乳是酸奶，其感官要求包括色澤等。為增加發(fā)酵乳的甜度，大部分乳制品企業(yè)會(huì)在生產(chǎn)過(guò)程中添加過(guò)量的安賽蜜，并不按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)添加。

安賽蜜又叫乙酰磺胺酸鉀，是一種食品添加劑，類似于糖精，易溶于水，可增加食品甜味，其沒(méi)有營(yíng)養(yǎng)，口感好[3]，無(wú)熱量，具有在人體內(nèi)不代謝、不吸收（是中老年人、肥胖病人、糖尿病患者理想的甜味劑），對(duì)熱和酸穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，是當(dāng)前世界上第四代合成甜味劑。安賽蜜為人工合成甜味劑，經(jīng)常食用合成甜味劑超標(biāo)的食品會(huì)對(duì)人體的肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)造成危害，特別是對(duì)老人、孕婦、兒童的危害更為嚴(yán)重。如果短時(shí)間內(nèi)大量食用，會(huì)引起血小板減少導(dǎo)致急性大出血。通過(guò)測(cè)評(píng)乳制品中安賽蜜的含量，能幫助人們?cè)谶x購(gòu)酸奶時(shí)，知道安賽蜜的含量，減少因食用安賽蜜后帶來(lái)的危害。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

1.1.1 儀器

高效液相色譜儀 Agilent 1200 HPLC 系統(tǒng)（美國(guó)），配置G1322A型四元梯度泵、G1311型二極管陣列檢測(cè)器、G1329A型柱溫度箱、G1316A型自動(dòng)進(jìn)樣器、Agilent Chemstation色譜工作站（version B.04.02），超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司KQ-300DE型)，離心機(jī)（湘儀H1580型)，電子天平（奧豪斯儀器（上海）有限公司，AR224CN型），隔膜真空泵（津騰GM-0.33型），濾膜（津騰微孔濾膜（有機(jī)系）直徑50 mm，孔徑0.45 μm）。

1.1.2 試劑

甲醇：色譜純，購(gòu)于賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，純度大于99.9%，批號(hào)20160606；乙腈：色譜純，購(gòu)于賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，純度大于99.9%，批號(hào)20160605；硫酸銨：分析純，購(gòu)于天津市風(fēng)船化學(xué)試機(jī)科技有限公司，純度大于99.0%，批號(hào)20160109；10%硫酸溶液：優(yōu)級(jí)純，購(gòu)于廣州汕頭市酉隴化工有限公司，含量95%～98%，批號(hào)20161016；乙酸銨：購(gòu)于天津市科密歐化學(xué)試機(jī)有限公司，純度大于98.0%，批號(hào)20160110；無(wú)水乙醇：購(gòu)于天津市風(fēng)船化學(xué)試機(jī)有限公司，純度大于99.7%，批號(hào)20161015。

1.2 高效液相色譜檢測(cè)條件

高效液相色譜儀 Agilent 1200 HPLC 系統(tǒng)（美國(guó)安捷倫）；紫外檢測(cè)器；自動(dòng)進(jìn)樣器；液相色譜柱：Dimonsil C18（2）：cat#99603，5 μm，250 mm×4.6 mm；流動(dòng)相：甲醇∶乙酸銨=10∶90；流速：1.000 mL/min；波長(zhǎng)：214 nm；進(jìn)樣量：20.00 μL；分析時(shí)間：10 min；柱溫：30 ℃。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

（1）流動(dòng)相的配制。稱取1.54 g乙酸銨于100 mL的燒杯中攪拌溶解，轉(zhuǎn)移至2000 mL燒杯中，采用蒸餾水少量多次洗滌，洗滌溶液合并轉(zhuǎn)移至2000 mL燒杯中，并加入蒸餾水至1000 mL刻度線，使用玻棒攪拌混和均勻，并超聲5 min，排除CO2，此溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用。

雨過(guò)天晴，剛出世的嬰孩靜靜地睡去了。風(fēng)吹拂著林梢，樹(shù)枝上那根濕漉漉的紅腰帶，在凄惶的寒風(fēng)中飄動(dòng)著。陽(yáng)光透過(guò)云層，照耀著潮濕的林間，濕氣氤氳中，倒也添了此許溫暖。紅琴問(wèn)風(fēng)影什么時(shí)候回寺院，他一聲不吭。許久，他才說(shuō)，紅琴，我們一起回家吧。她茫然地望著他，一頭霧水。他再次說(shuō)，回家吧。隨即，他上前扶起她，抱起熟睡的嬰兒，他們相扶著，一步一步地朝林子外邊移去。

（2）樣品前處理。稱取2.00 g酸奶樣品于10 mL具塞比色管中，加無(wú)水乙醇5.0 mL并加蒸餾水稀釋至10.0 mL，搖晃混勻并超聲10 min。超聲完畢，將溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，并于離心機(jī)上6000 r/min離心5 min。將離心后的溶液用定量濾紙過(guò)濾，得到的濾液并采用接0.45 μm過(guò)濾頭的注射器過(guò)濾至2 mL進(jìn)樣瓶中，待測(cè)。

（3）儀器檢測(cè)。將待測(cè)樣品于高效液相色譜檢測(cè)條件下排序檢測(cè)。

（4）數(shù)據(jù)處理。采用Origin70繪制相關(guān)圖譜及標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的選擇

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GBT 5009.140-2003中的流動(dòng)相組成和比例較為復(fù)雜。流動(dòng)相分別用到硫酸銨、甲醇、乙腈和稀釋為10%的硫酸。其中，硫酸銨800 mL、甲醇150 mL、乙腈50 mL、10%硫酸1 mL，且要求放入同一個(gè)瓶子中，超聲混勻。由圖1可以看出，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)乳制品中安賽蜜的色譜圖分離度不好且出現(xiàn)干擾峰。因此，本文在此基礎(chǔ)上改進(jìn)流動(dòng)的種類，尋求低成本、操作簡(jiǎn)單的流動(dòng)相。以云南乍甸乳業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)的牛乳之房（樣品1）、乳酸菌飲品（樣品2）和云南多喝乳業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)的原風(fēng)味酸奶（樣品3）、草莓調(diào)制乳（樣品4）為研究對(duì)象，考察流動(dòng)相改進(jìn)前后的高效液相色譜圖，其對(duì)照?qǐng)D如圖2所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用含乙酸銨的甲醇作為流動(dòng)相色譜圖分離度較好，沒(méi)有干擾峰的出現(xiàn)。所以，此方法適用于測(cè)定乳制品中安賽蜜的含量，同時(shí)也適用于測(cè)定食品中安賽蜜含量。

圖1 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法檢測(cè)乳制品中安賽蜜色譜圖

圖2 新方法檢測(cè)乳制品中安賽蜜色譜圖

2.2 流動(dòng)相比例的選擇

流動(dòng)相比例是高效液相色譜法進(jìn)行定性定量分析的關(guān)鍵參數(shù)，因此，實(shí)驗(yàn)對(duì)流動(dòng)相的比例進(jìn)行考察。以樣品1為研究對(duì)象，考察流動(dòng)相比例對(duì)樣品分離的影響。將所得待測(cè)液按1.2色譜條件進(jìn)樣，考察的流動(dòng)相（甲醇∶乙酸銨）比例分別為10∶90、15∶85、20∶80、25∶75和30∶70。將色譜圖原始數(shù)據(jù)用相似度軟件進(jìn)行分析，分析后可知在流動(dòng)相（甲醇∶乙酸銨）比例為10∶90的條件下，色譜圖分離得最好，故選流動(dòng)相（甲醇∶乙酸銨）比例為10∶90。

2.3 流動(dòng)相流速的選擇

流動(dòng)相的流速也是高效液相色譜法進(jìn)行定性定量分析的關(guān)鍵參數(shù)，因此，實(shí)驗(yàn)對(duì)流動(dòng)相的流速進(jìn)行考察。以樣品1為研究對(duì)象，根據(jù)1.3中的（2）（3）處理樣品，考察了流動(dòng)相比例對(duì)樣品分離的影響。將所得待測(cè)液按1.2色譜條件進(jìn)樣，其中檢測(cè)條件流動(dòng)相、波長(zhǎng)、梯度洗脫、柱溫、進(jìn)樣量不變，改變流速為0.800、1.000、1.200 mL/min。將色譜圖原始數(shù)據(jù)用相似度軟件進(jìn)行分析，后可知流速0.800、1.000、1.200 mL/min圖譜差異不大，出峰都可以。但由于在0.800、1.200 mL/min條件下的保留時(shí)間發(fā)生位移，相似度較差。故選澤流動(dòng)相流速1.000 mL/min。

2.4 線性回歸方程、線性范圍

對(duì)配制的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別于高效液相色譜儀上檢測(cè)分析，結(jié)果見(jiàn)表1，其中濃度為0.01 mg/mL的色譜圖見(jiàn)圖3。同時(shí)比較了標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的色譜圖，如圖4所示。

表1 工作標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測(cè)結(jié)果表

圖3 標(biāo)準(zhǔn)品中安賽蜜含量的檢測(cè)色譜圖

圖4 樣品和標(biāo)準(zhǔn)品中安賽蜜含量檢測(cè)對(duì)比色譜圖

2.5 分析方法的考察

2.5.1 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一供試樣品平行制備3份供試溶液，考察樣品中各成分含量的RSD，以此結(jié)果驗(yàn)證是否滿足色譜圖的測(cè)定要求。安賽蜜的含量（n=3）分別為0.025、0.024、0.027 g/kg，RSD分別為4.3%、3.8%、5.5%。表明重復(fù)性好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試樣品溶液，分別在0 h、5 h、15 h進(jìn)行樣品穩(wěn)定性情況考察。查看各組分的峰面積以及相對(duì)保留時(shí)間的RSD，以此證明樣品溶液時(shí)間的穩(wěn)定性。各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1.5%，相對(duì)峰面積的RSD小于10%，建立的色譜圖譜精密性比較好。說(shuō)明樣品在15 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.3 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

制備3份供試品溶液，另制備一個(gè)不加對(duì)照品溶液的空白對(duì)照溶液，以確定回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 乳制品中安賽蜜成分加標(biāo)的回收率

結(jié)果表明，方法的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和回收率均良好，滿足定量要求。

3 結(jié)論

通過(guò)改變國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法中的流動(dòng)相，建立安賽蜜的色圖譜，采用Origin70軟件對(duì)色圖譜進(jìn)行分析對(duì)比。結(jié)果如下：①國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法的流動(dòng)相分別用到硫酸銨、甲醇、乙腈和稀釋為10%的硫酸4種不同的化學(xué)試劑且配制復(fù)雜，特別是硫酸的稀釋，容易燒傷皮膚，稀釋過(guò)程中釋放的煙霧刺激人體呼吸系統(tǒng)，而自創(chuàng)方法中的流動(dòng)相配制簡(jiǎn)單且安全。②國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法得到的色譜圖分離程度不夠明顯，出現(xiàn)干擾峰，影響對(duì)安賽蜜出峰的判斷，自創(chuàng)方法得到的色譜圖分離度較好，沒(méi)有干擾峰的出現(xiàn)，能對(duì)安賽蜜的出峰情況和時(shí)間有一個(gè)很好的把控。同時(shí)，視覺(jué)效果比國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法好。③自創(chuàng)法得到的標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線良好，R2=0.99988。④自創(chuàng)法中方法的精密度，重復(fù)性，穩(wěn)定性均良好，RSD值小于10%，加樣回收率分別為103%、107%、110%，RSD值也小于10%。⑤通過(guò)自創(chuàng)法，測(cè)得的安賽蜜含量與供試品標(biāo)簽上標(biāo)的基本一致。

綜上所述，該實(shí)驗(yàn)所建立的高效液相色譜法測(cè)評(píng)乳制品中安賽蜜的分析方法快速、簡(jiǎn)單，方法可靠，可運(yùn)用其他乳制品中安賽蜜含量的測(cè)定。