◎ 蒙法雙

（北海市食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 北海 536000）

N-亞硝胺是一種強(qiáng)致癌性食品污染物[1]，食物、化妝品、啤酒、香煙中均含有亞硝胺類化合物。近年來，人們在飲用水、污水處理消毒后的水體以及直接受工業(yè)源污染的水體中也發(fā)現(xiàn)了亞硝胺類化合物，亞硝胺類化合物及亞硝化試劑與胺類物質(zhì)等前體物質(zhì)均是惡性腫瘤流行病學(xué)和病因?qū)W的重要內(nèi)容[2]。亞硝胺類化合物因其潛在的致毒致癌性而成為當(dāng)前的一大研究熱點(diǎn)[3]。本文探討啤酒中N-二甲基亞硝胺和N-亞硝基吡咯烷快速測定的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent GC7890B/MS7000C，美國Agilent公司），自帶CTC自動進(jìn)樣器；Panasonic MDF-U5412醫(yī)用低溫箱（-40 ℃，日本松下公司）；XA205DU精密電子天平（梅特勒-托利多上海公司）；3-18K高速臺式冷凍離心機(jī)（德國sigma公司）；5510E-DTH超聲波清洗器（美國BRANSONIC公司）；Si-T256渦旋混合器（美國Scientific Industries公司）；8200半自動凱氏定氮蒸餾儀（丹麥FOSS公司）；R-215平行蒸發(fā)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）。

1.2 試劑

N-二甲基亞硝胺（NDMA，濃度 100 μg/mL，Accustandard Inc.）、N-亞硝基吡咯烷（NPYR，濃度100μg/mL，Accustandard Inc.）；乙腈（色譜純，F(xiàn)isher Chemical公司）、二氯甲烷（色譜純，F(xiàn)isher Chemical公司）、氯化鈉（優(yōu)級純，天津光復(fù)公司）、無水硫酸鈉（分析純，廣東華大公司）、純生啤酒（市售），水為去離子水。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent122-7032DB-WAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。柱溫升溫程序：起始溫度40 ℃，保持1 min；以10 ℃/min升溫至110 ℃，再以15 ℃/min升溫至200 ℃，再以40 ℃/min 升溫至250 ℃，保持3.75 min；進(jìn)樣口溫度：250 ℃，隔墊吹掃流量：3 mL/min，進(jìn)樣模式：不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量：1.0 μL；載氣：He（純度＞99.999%），進(jìn)樣流速1.2 mL/min。質(zhì)譜條件：離子源溫度230 ℃；連接管線溫度250 ℃；電離方式為EI正離子模式；電子能量為70 eV；電子倍增器電壓為2000 V；選擇離子掃描（MRM）條件：m/z：74.0→44.1，42.1（NDMA）；100.0→55.1，70.0（NPYR）；溶劑延遲5 min（見表1）。

表1 兩種揮發(fā)性N-亞硝胺的質(zhì)譜分析參數(shù)表

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)使用液：分別吸取N-二甲基亞硝胺、N-亞硝基吡咯烷標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL，并置于10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻（此溶液為5 μg/mL）。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別吸取N-二甲基亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)使用液、N-亞硝基吡咯烷標(biāo)準(zhǔn)使用液各1.0 mL，并置于50 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻（此溶液為 100 μg/L）。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液曲線的制備：分別吸取0.1、0.5、1.0、2.0 mL和5.0 mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，并置于10 mL容量瓶中，配制成濃度為1.0、5.0、10、20 μg/L和50 μg/L的溶液，供氣相色譜-質(zhì)譜儀測定。

1.3.3 樣品的制備與處理

稱取均質(zhì)（盡量將樣品冷藏后均質(zhì)）試樣10 g（精確到0.01 g）于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋，在冰箱中冷凍30 min，加入2個陶瓷均質(zhì)子和Bond Elut QuEChERS萃取鹽，迅速振蕩30 s，10000 r/min在0 ℃低溫離心10 min。取上清液6 mL加入到15 mL Bond Elut QuEChERS基質(zhì)分散凈化管中，渦旋1 min，10000 r/min在0℃低溫離心10 min，取上清液過0.2 μm濾膜，GC-MS/MS檢測。

1.3.4 空白試驗(yàn)

除不加試樣外，其他操作與1.3.3同樣處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品制備的選擇

2.1.1 樣品提取方法的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)參考不同的文獻(xiàn)[4-12]，分別以水蒸氣蒸餾法[7]、超聲震蕩提取法[5]和冷凍萃取鹽提取法對樣品進(jìn)行前處理，比較3種處理下的結(jié)果，表明冷凍萃取鹽法比前兩法提取更完全，回收率更高，操作便捷，因此選擇了冷凍萃取鹽法提取樣品中的N-亞硝胺類物質(zhì)。

2.1.2 水蒸氣蒸餾法的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)還考察了定氮儀水蒸氣蒸餾法樣品和試劑4倍、10倍減量來提取操作，根據(jù)方法的檢出限0.3 μg/kg的量來加入，結(jié)果無法檢出峰或被樣品干擾；樣品回收率也均達(dá)不到冷凍萃取鹽提取方法的效果。

2.2 柱溫升溫速率的優(yōu)化

亞硝胺的分子質(zhì)量小，沸點(diǎn)低，出峰快，溶劑峰容易干擾，為達(dá)到最佳分離效果，需要優(yōu)化柱溫升溫速率。選擇柱溫起始溫度為40 ℃，分別比較升溫速率為5 ℃/min、10 ℃/min和15 ℃/min的分離效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：當(dāng)升溫速率為5℃/min時，溶劑峰與N-二甲基亞硝胺的色譜峰均無法明確分出；當(dāng)升溫速率為10 ℃/min時，能夠有效分離，而繼續(xù)升溫速率為15 ℃/min時，樣品雜質(zhì)峰與N-二甲基亞硝胺色譜峰的分離效果沒有明顯改善，因此選擇升溫速率為10 ℃/min。當(dāng)柱溫升高到110 ℃時，N-二甲基亞硝胺的色譜峰已出峰；在第二梯度將升溫速率提高為15 ℃/min時，才能有效的分離溶劑峰與N-亞硝基吡咯烷。因此，最終選擇柱溫為起始溫度40 ℃，保持1 min，以10 ℃/min升溫至110 ℃后，以15 ℃/min升溫至200 ℃，再以40 ℃/min 升溫至250 ℃，保持3.75 min。按照上述優(yōu)化條件，選擇電子轟擊電離源（EI），正離子模式，電子能量為70 eV，采集模式為MRM，對兩種N-亞硝胺混合標(biāo)樣分析，得到標(biāo)準(zhǔn)品的氣相色譜-質(zhì)譜總離子流圖如圖1所示。

圖1 兩種N-亞硝胺的色譜圖

2.3 方法的線性、檢出限、回收率和精密度

2.3.1 方法的線性、檢出限

精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.5、1.0、2.0 mL和5.0 mL分別置于10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋并定容，搖勻，配制成濃度為1.0、5.0、10、20 μg/L和50 μg/L的溶液，渦旋混勻30 s，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，取濾液按1.3.1中所述的色譜條件進(jìn)行測定，并記錄峰面積。利用定量離子峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。每個質(zhì)量濃度的樣品測定3次，以目標(biāo)物的峰面積Y對其質(zhì)量濃度X進(jìn)行回歸分析，得到各N-亞硝胺的線性方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍，見表2。

表2 兩種亞硝胺的線性范圍、回歸方程和檢出限表

2.3.2 回收率和精密度

將低、中、高不同質(zhì)量濃度水平的N-亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到啤酒陰性樣品中，再按照1.3.3處理和1.3.1所述條件進(jìn)行上機(jī)檢測，每個樣品平行測定6次，精密度和回收率結(jié)果見表3。由表3可知，本方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD)小于8%，回收率為80%～109%，表明本方法精密度和準(zhǔn)確度均較高。

表3 樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果表

2.4 樣品測定分析

取5批市售啤酒6批按1.3項(xiàng)實(shí)驗(yàn)方法分別測定N-二甲基亞硝胺、N-亞硝基吡咯烷的含量，每個樣品測定3次，取平均值，結(jié)果見表4。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法快速測定啤酒中兩種揮發(fā)性N-亞硝胺含量的分析方法，通過比較不同提取方法，優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)分析條件。GB 5009.26-2016前處理簡便快捷，靈敏度高，重現(xiàn)性良好。適用于高通量分析檢測N-亞硝胺類化合物，是一種易于操作，靈敏度高的測定方法。但目前GB 2762-2017中只有肉與肉制品和水產(chǎn)與水產(chǎn)制品的N-二甲基亞硝胺限量指標(biāo)，并沒有啤酒的限量指標(biāo)，更沒有N-亞硝基吡咯烷的任何限量指標(biāo)。