車向前,陳 芳,常明泉*,陳 林
白及溶膠是制備復方白及乳膏的前體原料,該溶膠是從蘭科植物白及塊莖中提取、脫色后制備而成[1]。復方白及乳膏具有軟化角質、促進細胞生長、抗氧化、保濕潤膚的功效[2-3],用于治療黃褐斑、干性皮炎、皮膚皸裂,也可用于魚鱗病、銀屑病的輔助治療[4]。白及可用于上消化道止血、抗?jié)儭⒎谓Y核、外用抗皸裂,也用于腫瘤的栓塞治療[5],目前,針對白及多糖的研究多集中于提取工藝、純化工藝[6],而對其中植物蛋白的研究僅局限于將其作為雜質去除。近年研究發(fā)現(xiàn),一些植物蛋白除具有動物蛋白的作用外,還具有較好的藥理活性,具有抗氧化、清除皮膚自由基的功能,該作用能抑制黃褐斑的生長,減退黃褐斑。復方白及乳膏能使黃褐斑減退并抑制其生長,可能與其含有一定量的植物蛋白有關[7],為明確其藥理作用和活性成分,更好地控制復方白及乳膏的質量,本文應用硝酸硝化顯色法、色譜鑒別法對白及溶膠中的植物蛋白進行定性鑒別,應用考馬斯亮藍染色法對其中的植物蛋白進行定量檢測。
1.1 儀器 TU-1901型分光光度儀(北京普析通通用儀器有限責任公司);BCD-610W型冰箱(博西華家用電器有限公司,功率:1.07 kW);KM-410C型超聲震蕩儀(廣州市科潔盟實驗儀器有限公司,40 kHz);WE-AS-10型實驗室純水機(深圳市宏森環(huán)??萍加邢薰荆β剩?00 W);XPE-分析天平(梅特勒-托利多公司,精度0.1 mg);MH-1000型電熱套(北京科偉永興儀器有限公司,300 W);試管架(江蘇新康醫(yī)療器械有限公司,13×50);玻璃試管(20 ml、10 ml)。
1.2 試藥 白及溶膠(太和醫(yī)院自制,批號:20170322、20170410、20170416);牛血清蛋白對照品(中檢院,批號:160427-203942,25.0 mg/瓶);考馬斯亮藍G-250(購自成都艾科達化學試劑有限公司,CBB,批號:6401-58-1);乙醇(武漢市中天化工有限責任公司,批號:20161225,分析純);85%磷酸(武漢市中天化工有限責任公司,批號:20161212,分析純);85%濃硝酸(武漢市中天化工有限責任公司,批號:20160701,分析純);NaCl(沈陽試劑廠,批號:2016010599,含量95%~100.05%,基準試劑);純化水(太和醫(yī)院新鮮)。
2.1 定性鑒別
2.1.1 硝化反應 陽性對照:取濃度為1 mg/ml的蛋白質對照品溶液2 ml于試管中,滴加濃硝酸2滴,靜置2 min,觀察顏色變化,結果呈黃色。供試品溶液:取白及溶膠0.1 g于試管中,加純化水2 ml,超聲分散溶解,滴加濃硝酸2滴,靜置2 min,觀察顏色變化,結果呈黃色,與對照品反應顏色一致。陰性對照:取純化水2 ml于試管中,滴加濃硝酸2滴,靜置2 min,觀察顏色變化,結果澄清,無黃色呈現(xiàn)。
2.1.2 色譜鑒別 陽性對照:取濃度為10 mg/ml的蛋白質對照品溶液5 ml,加入雙縮脲試劑5 ml,搖蕩均勻,顯紫色;供試品溶液:取白及溶膠10 g,加純化水10 ml,超聲溶解,過濾,收集濾液在水浴上蒸發(fā)至5 ml,加入雙縮脲試劑5 ml,搖蕩均勻,顯紫色;陰性樣品溶液:取純化水5 ml,加入雙縮脲試劑5 ml,搖蕩均勻,溶液呈淺藍色,無紫色出現(xiàn)。取上述3種染色液,以相應試劑為空白,在紫外分光光度儀上于400~700 nm波長處掃描,結果對照品溶液和供試品溶液在540 nm處均有最大吸收峰,陰性樣品溶液在該波長處無最大吸收。
2.2 定量檢測
2.2.1 溶液的制備 ①0.15 mol/L NaCl溶液的制備:精密稱取0.438 7 g NaCl于50 ml容量瓶中,加純化水溶解,定容,即得。②考馬斯亮藍染色液的制備:精密稱取考馬斯亮藍50 mg溶于25 ml乙醇中,加入磷酸50 ml,混合,加純化水稀釋至500 ml,即得。③蛋白質對照品溶液的制備:精密稱取牛血清蛋白對照品10 mg,置10 ml容量瓶中,加純化水溶解,定容,即得1.0 mg/ml蛋白質對照品儲備液,該溶液置冰箱中低溫保存(4 ℃),取該溶液0.2 ml于試管中,加0.15 mol/L NaCl溶液至2.0 ml,加入考馬斯亮藍G-250溶液10.0 ml,混勻,在室溫放置5 min,使其反應充分,即得。④樣品溶液的制備:取白及溶膠0.1 g于試管中,加0.15 mol/L NaCl溶液至2.0 ml,超聲溶解,加入考馬斯亮藍G-250溶液10.0 ml,混勻,放置5 min,使其反應充分,即得。⑤空白樣品溶液的制備:精密吸取0.15 mol/L NaCl溶液2 ml于試管中,加入考馬斯亮藍G-250溶液10.0 ml混勻,在室溫放置5 min,使其反應充分,即得。
2.2.2 測定波長的選擇 分別取“2.2.1”項下的蛋白質對照品溶液、樣品溶液和空白樣品溶液,在分光光度儀上于500~700 nm波長處掃描,記錄掃描圖,結果除空白樣品溶液外,蛋白質對照品溶液、樣品溶液在595 nm處都有最大吸收,設定595 nm為測定波長,掃描圖見圖1。
圖1 紫外掃描圖
2.2.3 曲線方程的建立 分別精密吸取“2.2.1”項下濃度為1.0 mg/ml的蛋白質對照品儲備液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml于10 ml試管中,每管加0.15 mol/L的NaCl溶液至1.0 ml,混勻,分別取0.1 ml于對應編號的新試管中,分別加入考馬斯亮藍G-250溶液5.0 ml混勻,放置5 min,使其反應充分,即得每毫升含蛋白質對照品為3.92、7.84、11.76、15.69、19.61 μg的溶液,取各溶液分別在設定波長處測定吸收度,讀數(shù)3次,取均值,用濃度值作為橫坐標,用測得的吸收度值作為縱坐標,制定曲線方程:Y=0.036 X-0.000 5,r=0.999 5,蛋白質對照品在3.92~19.61 μg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關系。
2.2.4 精密度試驗 取“2.2.1”項下的蛋白質對照品溶液和空白樣品溶液,在設定波長處連續(xù)測定吸光度5次,結果RSD為0.77%。
2.2.5 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.1”項下經(jīng)染色后的蛋白質對照品溶液,在設定波長處于0、1、3、6 h測定,記錄吸光度值,結果RSD為1.89%,表明蛋白質對照品溶液在6 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.2.6 重復性試驗 平行精密稱取白及溶膠0.1 g于試管中,共5份,按“2.2.1”項下樣品溶液制備方法制備溶液,取“2.2.1”項下的空白樣品溶液,在設定波長處測吸光度,計算每份樣品的含量,結果RSD為1.34%。
2.2.7 回收率試驗 精密稱取已知含量的白及溶膠(批號:20170410)0.05 g,共9份,每3份為1組,分別按樣品含量的80%、100%、120%加入蛋白質對照品溶液,按“2.2.1”項下樣品溶液的方法制備,取該項下的空白樣品溶液,在設定波長處測吸光度,計算各樣品溶液的含量,回收率計算結果見表1。
表1 白及溶膠中植物蛋白回收率實驗表(n=9)
2.2.8 含量測定 精密稱取白及溶膠0.1 g(批號:20170322、20170410、20170416)于試管中,每個批號各3份,按“2.2.1”項下的方法制備樣品溶液,取該項下的空白樣品溶液,于設定波長處分別測定各份樣品溶液的吸光度值,結果見表2。
表2 白及溶膠中植物蛋白含量測定結果(n=3)
植物蛋白中具有苯環(huán)的氨基酸結構,這類物質遇濃硝酸生成黃色化合物,既硝化現(xiàn)象[8],利用該原理可以對白及溶膠中的植物蛋白進行定性鑒別。蛋白質分子中含有很多似雙縮脲結構肽鍵,雙縮脲試劑是一個藍色的含銅堿性試劑,能與蛋白質中的肽鍵形成紫色的絡合物,顏色深淺與蛋白質濃度成正比,雙縮脲試劑染色后的含蛋白質溶液在紫外可見光譜為540 nm的波長處有最大吸收[9],應用該原理可以對白及溶膠中的植物蛋白進行色譜鑒別。白及溶膠溶解液蒸發(fā)是為了縮小體積提高濃度,增加染色時的靈敏度。
考馬斯亮藍G-250在游離狀態(tài)下呈紅色,與蛋白質發(fā)生特異性結合后立即呈現(xiàn)藍色。該溶液在紫外分光光度儀上在一定的波長范圍內(nèi)具有最大吸收,在相應濃度范圍內(nèi),蛋白質與染色劑的結合量與測定波長的吸光度值成正比[10],因而采用考馬斯亮藍染色法測定白及溶膠中的植物蛋白含量。
白及溶膠中不僅有多糖、植物蛋白,還有植物色素等物質,植物色素可能也產(chǎn)生一定的光密度值,因此,在配制樣品時,應使蛋白質濃度在0.1 mg/ml以內(nèi),必要時適當增加考馬斯亮藍染色液的用量,以保證與蛋白質染色反應完全,減小其他成分對蛋白質測定可能產(chǎn)生的影響。酸堿對植物蛋白的測定會有一定影響,樣品配制時加入0.15 mol/L NaCl溶液稀釋,可緩沖其影響。在測定實驗之前應把本實驗所用器具用鉻酸鉀清潔液浸泡、用純化水清洗干凈,并避免使用石英吸收池,防止用具不潔對測定結果產(chǎn)生干擾,每次測定完畢用乙醇清洗比色皿,然后用純化水清洗,以免考馬斯亮藍染色液在比色皿上存在殘留。